茶树咖啡碱合成途径中疑似N-甲基核苷水解酶的原核表达及活性验证

摘要

在已知的50000多种植物次级代谢产物中,有约12000种为生物碱。咖啡碱是其中非常重要的一种,存在于咖啡(Coffea arabica)、茶树(Camellia simensis)、可可(Cola nitida)等许多重要经济作物中。咖啡碱具有多种生理功能,现已广泛应用于医药和食品领域。
　　茶树中的咖啡碱合成主要在嫩叶中,其他组织中也有少量合成。咖啡碱的生物合成途径已研究明确:从黄嘌呤核苷经转甲基作用生成7-甲基黄嘌呤核苷,脱核糖作用生成7-甲基黄嘌呤,转甲基生成可可碱,进而生成咖啡碱。
　　目前,咖啡碱合成途径中所需的相关酶得调控基因已在咖啡中得到克隆和表达,茶树中发现了能够催化后两步转甲基作用的酶TCS(咖啡碱合成酶),而第二步N-甲基核苷水解酶的分子调控研究尚未见报道。
　　低咖啡碱饮品的市场前景广阔,咖啡碱本身也有相当大的市场需求。研究咖啡碱合成途径关键酶的基因调控过程,特别是第二步的N-甲基核苷水解酶的基因调控,对低咖啡碱茶树品种的培育具有重要意义,同时可以促进生物合成咖啡碱的实现。
　　本文从茶树基因组文库中筛选了茶树叶中疑似N-甲基核苷水解酶的基因,并在大肠杆菌中得到表达,研究了表达蛋白的生物活性,得到以下结果:
　　1.筛选出三个候选的茶树N-甲基核苷水解酶(STx)基因序列,在大肠杆菌载体pGEX-4t-2中得到表达,表达蛋白可溶;
　　2.以XR为底物,检测到表达蛋白能够催化脱核糖反应;
　　3.将STx与咖啡中获得的CaXMT混合反应,检测到的反应产物7-MX的含量相比于CaXMT单独反应时无增加。
　　由于市面上没有N-甲基核苷水解酶所需直接底物7-MXR标准品销售,所以对候选STx的真正功能尚有待进一步研究。

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目录

1 文献综述

1.1咖啡碱的生理功能

1.2低咖啡碱茶饮的研究进展

1.3茶树体内咖啡碱合成途径研究

2 引 言

2.1研究意义

2.2技术路线

2.3研究内容

3 材料与方法

3.1材料

3.2仪器与试剂

3.3方法

4 结果与分析

4.1N-甲基核苷水解酶在大肠杆菌中的表达

4.2 STx酶的体外酶活性检测

4.3 STx酶的体内酶活性检测

4.4 7-MXR的试制备

5 结论与讨论

5.1结论

5.2讨论

参考文献

附录A. 英文缩写及注释

附录B. 茶树候选核苷酶STx及内参基因的核苷酸序列

致谢

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