恒定链CLIP两个片段增强体液免疫效果的比较

摘要

主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)，由紧密连锁的多态性是高度相关的一组基因组家庭，它们是一个特定的染色体；其编码的基因表达于不同的细胞表面，在细胞的免疫应答过程中参与抗原的递呈。MHCI基因和MHCⅡ基因的两个亚科的主要基因MHC分子家族，在内质网中，γ链三聚体的MHC II类α，β-链及其聚合和聚合，形成特殊的九聚体(αβγ)3结构[1]。二十世纪七十年代末，长期从事小鼠分子功能性研究的Jones等学者[2]在研究时获得了意外发现，α、β、γ三条链并非都是高度多态性，γ链是非多态性的，此现象在当时所发现的各种小鼠中都是存在的，从而首次将γ链定义为恒定链（Invariant chain，Ii）。Ii是MHC II分子的伴侣蛋白，在维持Ii三聚体和MHC II六聚体之间结合结构稳定性以及在机体免疫应答的过程中的作用异常的明显[3,4]。不止于此方面，Ii的CLIP在抗原呈递过程中，会最早的结合到MHC II类分子的凹槽结构中，阻止某些机体在内质网中合成的内源性多肽与之结合[5]，经过在细胞内的相关物质的转移，Ii在特定的环境条件下被一点点的分解掉，最后分解CLIP，使其从MHC II类分子的结合凹槽中消失、某些特殊的抗原肽结合到这一结构凹槽中，最终被呈递到特定的免疫细胞表面[6]。近年来有相关学者研究发现，用外源性的抗原肽替换Ii的CLIP区，能够有效的增强免疫效果，这说明Ii是一直新型的免疫载体。随着研究的深入，Ii自身的功能和结构以及在免疫应答过程中的活动机理渐渐被人们所证实。
　　Ii的胞内结构域，跨膜区和内质网区3个区域组成，其主要功能是辅助MHCⅡ类分子的外源性抗原肽。其81-216位的内质网腔区含有CLIP（Class II-associated invariant chain peptide，81-104 aa）和三聚体区（TRIM, Trimerization）两个主要片段。研究表明，在Ii的CLIP存在与MHCII类分子的结合位点（CBS，Class II binding site）片段。CBS片段又分为两个功能片段，即与所有多态性MHCII结构相关的混合结合位点（PBS，promiscuous binding site，81-87 aa）片段和沟槽结合位点（GBS，groove binding site，91-99 aa）片段。当Ii的CLIP与MHCII类分子结合时，PBS存在于MHCII类分子的肽结合沟槽外部，同CLIP与MHCII类分子的解离有关，而GBS与MHC II类分子的肽结合沟槽相互作用。
　　首先，通过对Ii的序列分析后，将其划分为胞浆区、跨膜区、CLIP区、三聚体区，其中CLIP区又划分为PBS、GBS两个区，分段设计引物，同时用实验室前期筛选的新城疫病毒NDV F蛋白的优势抗原表位F2，通过重叠延伸PCR技术，克隆构建出含有F2抗原表位和不同Ii片段的嵌合体，将其构建到pET-32a载体中，并将单独的F2抗原表位连接到pGEX-4T-1载体中。通过PCR以及测序结果表明，所构建的多组重组质粒中均含预期片段。
　　其次，对用于小量诱导表达构建的8个重组质粒，进行了诱导时间、IPTG浓度、诱导温度等多方面原核表达条件的优化，以最佳条件进行大量表达。实验中通过聚丙烯凝胶电泳检测，8个重组质粒均能在E.coli（DE3）中正确诱导表达，分子量分别为GST/F2：29.9 kDa、His/F2：23.9 kDa、His/Cyt/TM/F2：32.8 kDa、His/Cyt/TM/F2/GBS：34.7 kDa、His/Cyt/TM/PBS/F2：34.4 kDa、His/Cyt/TM/F2/TRIM：45.1 kDa、His/Cyt/TM/F2/GBS/TRIM：46.9 kDa和His/Cyt/TM/PBS/F2/TRIM：46.7 kDa，与理论预期结果相符。我们将大量表达所得到的菌液进行洗涤离心、反复冻融以及超声波破碎处理后，SDS-PAGE电泳检测其表达形式，再通过Native-PAGE（非变性非还原性PAGE）和0.25 mol/L KCl切胶纯化法进行纯化蛋白，得到浓度和纯度均满足实验所需。
　　最后，用前期所得到的融合蛋白免疫6周龄的SPF级昆明系雌性小鼠。32只小鼠分8个组，期中7个组为实验组，1个组空白对照组，每组4只。三次免疫间隔周期分别为10天和7天，第三次免疫后7天，经眼球采血，分离收集血清抗体。再通过间接 ELISA法摸索最佳实验条件，条件成熟后检测不同的实验组的抗体效价。结果表明，一是所构建的含不同Ii功能片段/F2嵌合体的6个免疫组，均比单独F2的免疫组提高抗体水平1.5–4.9倍；二是在上述6个免疫组中，含CLIP的PBS或GBS的免疫组比不含CLIP的免疫组增强1.6-2.4倍；三是含PBS比含GBS的免疫增强作用高1.5倍。因此，我们得到结论，Ii胞浆区、跨膜区具有增强免疫的作用，而CLIP的PBS在Ii免疫载体中的作用优于GBS。
　　综上所述，本实验成功克隆了基于小鼠Ii的CLIP区两个片段和NDV F蛋白F2优势抗原表位的基因片段，连接到 pGEX-4T-1、 pET-32a载体上，经过大肠杆菌诱导表达后纯化得到目的蛋白，免疫小鼠，检测抗体效价，分析不同实验组的效价水平。结果表明，Ii的活性片段Cyt/TM和CLIP均具有增强体液免疫的功能，其中，CLIP区两个片段增强作用有差异。在临床应用恒定链活性片段的疫苗载体模型上这些研究奠定了理论基础。

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文献综述

1 Ii的研究概况

2 Ii的生物学功能

3新城疫病毒

4 研究的目的及意义

引言

1材料与方法

1.1 实验材料

1.2Ii不同片段与NDV F2基因片段的原核表达

1.3多克隆抗体的制备与抗体效价测定

2 结果与分析

2.1 嵌合体片段的鉴定结果

2.2重组质粒的表达与鉴定

2.3 含有GST和His标签的融合蛋白提取与纯化鉴定

2.4 多抗效价的测定

3 讨 论

3.1 Ii作为免疫载体增强免疫效果的应用

3.2 E.coli表达系统

3.3 SDS-PAGE与Native-PAGE的应用选择

3.4 Ii新型免疫载体的应用展望

结论

参考文献

致谢

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