基于鸡恒定链功能片段通用载体免疫增强作用的研究

摘要

恒定链(invariant chain,Ii)是MHCⅡ类分子的伴侣蛋白,在抗原递呈过程中起重要作用。因Ii呈非多态性,故命名为恒定链。研究表明,小鼠恒定链中的Ii-key可以作为免疫载体,与抗原表位连接后,能够增强免疫应答;其他功能片段也能促进这种作用。本文旨在以鸡恒定链功能片段作为载体,研究跨物种增强免疫应答的可能性及其机制。
　　根据鸡恒定链Ii的结构,即胞浆区、跨膜区、Ii-key(CLIP区N端相连的四个氨基酸序列LQRK)、CLIP和AP(CLIP区C端的两个氨基酸序列Ala-Pro),构建了与新城疫病毒抗原表位F2连接的嵌合体(Ii-F2、Cyt/TM/Ii-key/F2/AP、TM/Ii-key/F2/AP、Ii-key/F2/AP、Ii-key/F2)。用设计的引物,以实验室保存的质粒pEGFP-C1-Ii、pGEX-4T-1-F306为模板,通过PCR及重叠延伸PCR的方法,扩增目的片段,分别插入pGEX-4T-1和pET-32a原核表达载体中。通过双酶切鉴定及测序结果比对,表明正确地构建了含嵌合体的重组质粒。
　　将构建的重组质粒导入工程菌,加入1.0mmol/LIPTG诱导表达,再经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。优化融合蛋白的表达条件,并进行大量表达。用反复冻融和超声波破碎的方法裂解表达菌,提取融合蛋白。获得的可溶性表达融合蛋白(His-Ii-key/F2/AP、His-Ii-key/F2、His-F2)经改良的KCl染色切胶法纯化,以包涵体形式表达的蛋白(His-Ii-F2、His-Cyt/TM/Ii-key/F2/AP、His-TM/Ii-key/F2/AP)经过透析复性后再纯化。分别获得分子量约为44.7kDa、32.3kDa、29.2kDa、24.4kDa、24.0kDa和23.8kDa的六组纯化蛋白,与理论结果一致。
　　将纯化的融合蛋白抗原免疫6-8周龄的雌性昆明系小鼠,经三次强化免疫后取特异性抗血清,用ELISA法检测血清抗体效价。同对照组单纯F2抗原组比较,Ii-key/F2免疫小鼠可将抗体水平提高1.5倍,Ii-key/F2/AP组抗体水平增强了2.5倍,而Ii的胞浆区(TM/Ii-key/F2/AP)和跨膜区、胞浆区(Cyt/TM/Ii-key/F2/AP)免疫组及F2取代Ii的CLIP区组(Ii-F2)的抗体增强了约3倍。Westernblot分析得知,得到的均为特异性的多克隆抗体。
　　综上,本实验通过原核表达融合蛋白并免疫小鼠,间接ELISA法测定多抗效价,表明以鸡Ii功能片段为基础构建的嵌合体在小鼠体内均具有不同程度的免疫增强作用,从而为探索在不同物种间具有免疫增强作用的通用载体提供了有价值的数据。

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文献综述

引 言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.3多克隆抗体的制备与抗体效价测定

1.4 多克隆抗体的特异性分析

2 结果与分析

2.1 嵌合体片段的鉴定结果

2.2嵌合体重组质粒序列的测定比对

2.3 嵌合体重组质粒的原核表达与鉴定

2.4 嵌合体融合蛋白表达条件的优化

2.5 嵌合体融合蛋白可溶性表达的鉴定

2.6 嵌合体融合蛋白的纯化

2.7 BSA标准曲线及蛋白浓度的测定

2.8 嵌合体诱导的抗体水平

2.9 多克隆抗体的Western blot特异性分析

3 讨 论

3.1 原核表达载体的选择

3.2 重组质粒的构建方法

3.3 蛋白纯化方法的选择

3.4 鸡恒定链跨物种免疫效果的分析

4 结 论

附录

参考文献

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