不同类型玉米胚乳转录组及其淀粉代谢相关基因分析

摘要

玉米是重要的粮饲和工业原料作物，玉米胚乳占籽粒重量的80％-85%，胚乳细胞的发育、增殖和充实情况决定了籽粒的重量和品质，深入研究玉米胚乳发育及形成过程对提高玉米的产量和品质具有重要的意义。本研究以高直链玉米（T1）、甜玉米（T2）、糯玉米（T3）和普通玉米（T4）四种籽粒胚乳淀粉组成不同的玉米自交系胚乳为材料，采用基于 Ilumilla/Solexa测序的 RNA-Seq技术构建了不同玉米自交系胚乳的转录组文库，筛选了不同自交系玉米胚乳差异表达基因，并对差异表达基因的COG功能分类、GO显著富集和Pathway显著富集进行了分析，同时对胚乳发育相关的转录因子进行分析筛选及候选基因的克隆主要研究结果如下：
　　1.应用 Illumina/Solexa测序平台对高直链、甜、糯和普通玉米胚乳进行转录组测序，分别获得21,127,794、18,139,530、18,292,192和20,041,927个clean read，参照B73基因组分析模式，拼接组装共获得43540个基因。通过插入片段检验、比对统计分析、cDNA片段随机性实验检验和基因覆盖度统计等质量评估表明Solexa测序质量满足后续各项数据分析。
　　2.对玉米不同自交系胚乳的基因进行可变剪接事件的分析得出，不同类型玉米胚乳基因主要以外显子跳跃（Exon skipping）和内含子滞留（Intron retention）的方式进行可变剪接。高直链、甜、糯玉米胚乳发生可变剪接的基因数目和事件要明显高于普通玉米胚乳，说明高直链、甜、糯玉米胚乳转录组组分及其相对丰度发生较大差异，这些差异的基因和可变剪接模式可能在胚乳发育过程中影响其基因表达。同时筛选得到9个剪接调控因子（SR），SR基因主要高表达于高直链玉米胚乳和糯玉米胚乳中，表明直链淀粉和支链淀粉的形成过程中相关基因的剪接大多受其调控。在淀粉合成途径中ADPase酶类、分支酶类和去分支酶类大多数基因在不同自交系中均未发生可变剪接，表现出较高的稳定性，部分基因在不同自交系中其剪接及方式表现出差异如ZmBEIIb(ae)只在糯玉米胚乳中以3’端位点的可变剪接（Alternative3'splice site）方式进行可变剪接、ZmAGPL1(sh2)只在甜玉米中以末位外显子剪接方式进行可变剪接（Alternative last exon），这些剪接差异可能与淀粉合成及其组成差异相关。
　　3.玉米胚乳的形成与灌浆期籽粒细胞内的信号传递、细胞防御、抗氧化平衡、碳代谢、转录调控和蛋白降解等基因功能类群和调控网络途径密切相关。基因表达谱分析发现，以普通玉米为参比，高直链、甜和糯玉米胚乳中极显著差异表达基因（P<0.01）525个，其中上调的有324个，下调的有201个。结合差异基因的相关功能注释，将此525个差异表达基因分为15个功能类别，其中有6个是主要功能类别基因群（信号传递、细胞防御、抗氧化平衡、碳代谢、转录调控和蛋白质降解），说明玉米不同胚乳的形成可能与这些主要功能类别基因群和调控网络途径密切相关。
　　4.构建了差异表达基因淀粉代谢的 Pathway，以普通玉米胚乳为对照，高直链、甜和糯玉米胚乳分别筛选得到19个、17个和24个差异表达基因，主要涉及淀粉合成过程中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶（直链淀粉合成酶和支链淀粉合成酶）、淀粉分支酶及淀粉去分支酶。高直链胚乳中ZmGBSSIIb的表达量要明显高于普通玉米胚乳，表明高直链玉米胚乳中直链淀粉合成能力要高于普通玉米；此外，可溶性淀粉合成酶ZmSSI、ZmSSIIa、ZmSSIIb、和ZmSSIV高表达于糯玉米胚乳中，表明不同亚型的可溶性淀粉合成酶在支链淀粉合成中发挥的催化作用不同，且共同负责支链淀粉的合成。此外在甜玉米胚乳中 ADPG焦磷酸化酶ZmAGPL3和ZmAGPL1（sh2）的表达量明显低于普通玉米胚乳，表明在淀粉合成过程中 ADPG焦磷酸化酶活性抑制或丧失，从而阻碍甜玉米胚乳中淀粉的积累，促进可溶性糖的形成。
　　5.通过筛选差异表达基因一共获得100个转录因子涉及19个主要的转录因子家族，进一步构建了这些转录因子与淀粉合成相关基因的共表达调控网络，结合差异表达基因在不同类型玉米胚乳中的表达模式，筛选得到5个重要的转录因子，并从玉米自交系 B73中克隆了位于调控网络中心位置的基因 ZmNAC116，通过SDS-PAGE分析该蛋白大小与预测大小相近，在上清中的表达量要高于沉淀。表达分析发现 ZmNAC116基因只在种子中表达，且在胚乳中的表达量很高。通过基因枪轰击洋葱表皮细胞的瞬时表达分析显示，ZmNAC116-GFP融合表达蛋白定位在细胞核中。过量表达 ZmNAC116的转基因水稻在生长表型上与对照植株没有明显差异。
　　综上所述，本文利用 RNA-Seq技术构建了不同类型玉米胚乳转录组文库，筛选了差异表达基因，并对差异表达基因的GO和Pathway显著富集进行了分析，获得了与胚乳形成有关的显著富集条目，利用差异表达基因在不同类型玉米胚乳中的表达模式结合转录因子与淀粉合成相关基因的共表达调控网络筛选获得并克隆了ZmNAC116，并对其分子生物学特性进行分析。本研究为玉米胚乳形成和淀粉合成的分子机制奠定了一定理论基础，同时对优良玉米新种质的创建具有重要意义。

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第一章文献综述

1.1玉米籽粒胚乳发育研究进展

1.2玉米淀粉合成机制

1.3玉米胚乳发育的分子机理研究进展

1.4基于高通量测序技术的转录组研究

1.5 转录因子的研究进展

1.6植物转录因子的功能

引言

一、研究内容

二、技术路线

第二章不同类型玉米胚乳转录组文库的构建及分析

2.1材料与方法

2.2实验与分析方法

2.3结果与分析

讨论

第三章不同类型玉米胚乳转录组差异分析

3.1材料与方法

3.2 结果与分析

讨论

第四章淀粉合成相关转录因子筛选及候选基因的克隆

4.1材料与方法

4.2 结果与分析

讨论

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介

博士发表的主要论文