石榴木质素生物合成关键基因及MYB转录因子的克隆与表达

摘要

石榴（Punica granatum L.）具有广泛的经济价值，集食用、观赏、绿化、药用于一体。石榴籽粒包含假种皮、种皮和种仁三个部分，其中硬籽石榴中种皮木质素含量较高，食用不便，而软籽石榴中种皮木质素含量较低，核软可食，无需吐籽，是珍贵的石榴种质资源。目前关于石榴软籽性状形成的分子机制研究较少，本试验以3个不同籽粒硬度的石榴品种“突尼斯软籽”、“会理软籽”和“红玉石籽”为试材，采用RACE技术克隆木质素生物合成途径关键基因和MYB转录因子基因，qRT-PCR技术监测上述基因在石榴不同组织、不同发育时期和不同品种石榴种皮中的相对表达量，探讨其在石榴木质素生物合成中的表达调控，为进一步研究石榴软籽性状形成机理奠定基础。试验获得的主要结果如下：
　　1、获得木质素生物合成关键基因PgPAL的3′端序列和PgCCR、PgCOMT、PgLAC的cDNA全长序列。生物信息学分析表明，PgPAL氨基酸序列与蓖麻、葡萄、欧洲大叶杨的一致性均为90％。PgCCR（GenBank登录号：KM881713）序列全长1269 bp，编码区（CDS）为1017 bp，编码338个氨基酸，其氨基酸序列与橡胶树、沙梨、大麻槿、冈尼桉、欧洲大叶杨的一致性超过82%。PgCOMT（GenBank登录号：KJ713968）序列全长1456 bp，编码区（CDS）为1113 bp，编码370个氨基酸，其氨基酸序列与仙女扇、蓖麻、扁桃、赤桉的一致性超过86%。PgLAC（GeneBank登录号：KM881711）序列全长2128 bp，编码区（CDS）为1716 bp，编码571个氨基酸，其氨基酸序列与葡萄、茸毛烟草、可可树、苹果的一致性超过80%。
　　2、克隆到MYB转录因子基因PgMYB和PgMYB1，生物信息学分析表明PgMYB和PgMYB1的N端都具有两个MYB DNA结合结构域，是植物中典型的R2R3-MYB转录因子。其中PgMYB（GenBank登录号：KM014568）序列全长为1088 bp，编码区（CDS）为921 bp，编码306个氨基酸，其氨基酸序列与银合欢、杨树、拟南芥的一致性超过84%。PgMYB1（GenBank登录号：KM881712）序列全长987 bp，编码区（CDS）为792 bp，编码263个氨基酸，其氨基酸序列与金鱼草、可可树、巨桉、茸毛烟草的一致性超过71%。
　　3、荧光定量分析表达发现，木质素生物合成关键基因和MYB转录因子基因在石榴的叶片、花瓣和茎中均有不同程度的表达，PgCCR、PgCOMT、PgLAC和PgMYB均是在茎中相对表达量最高，其次是在花瓣中表达较高，叶片中相对表达量最低，PgPAL和PgMYB1则是在花瓣中相对表达量最高，其次是在叶片中表达较高，茎中相对表达量最低。
　　4、在不同发育时期石榴种皮中，PgPAL、PgCCR和PgLAC的表达基本呈现一个先上升后下降的趋势，且都在盛花后80 d达到最高，PgCOMT的表达随着石榴种皮的发育先下降后上升。转录因子PgMYB和PgMYB1的表达趋势一致，在盛花后20 d相对表达量最高，且随着发育进程和木质素含量的上升反而逐渐下降。
　　5、在不同籽粒硬度石榴品种种皮中，PgCCR、PgCOMT、PgLAC和PgMYB1的表达模式基本相同，与石榴籽粒硬度和总木质素含量较为一致，籽粒硬度和种皮总木质素含量较低的品种，基因表达量相对较低，籽粒硬度和种皮总木质素含量较高的品种，基因表达量相对较高。PgPAL和PgMYB则是在籽粒硬度和种皮总木质素含量较低的品种中表达量相对较高，在籽粒硬度和种皮总木质素含量较高的品种中表达量相对较低。

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1 文献综述

1.1 石榴籽粒硬度与木质素

1.2 木质素的生物合成途径

1.3 植物MYB转录因子研究进展

2 引 言

2.1 研究的目的和意义

2.2 研究的内容

2.3 技术路线

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.2 试验仪器

3.3 主要试剂

3.4 试验方法

4 结果与分析

4.1 总RNA的提取及cDNA检测

4.2 石榴木质素合成关键基因和MYB转录因子基因的克隆

4.3 石榴木质素合成关键基因和MYB基因生物信息学分析

4.4 石榴木质素合成关键基因和MYB转录因子基因表达分析

5 讨 论

5.1 石榴木质素生物合成关键基因的表达特性

5.2 石榴MYB转录因子基因的表达特性

5.3 相关基因在木质素合成途径中的作用模式

6 结 论

参考文献

致谢

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