杨树转录因子MYB6调控类黄酮和木质素生物合成的机制研究

摘要

次生代谢产物在植物生长发育、抵御环境胁迫中扮演着十分重要角色。作为植物体内广泛存在的一类次生代谢产物，苯丙烷类化合物（花青素、单宁和木质素等）在植物生长发育中起着重要作用。在林木遗传育种研究中，提高树木体内花青素和单宁含量，可增强其对生物和非生物胁迫的抵御能力。另一方面，改变木材中木质素含量或组分，则有利于更好地开发利用木材资源。前人的研究表明， MYB转录因子作为植物中一个大的转录因子家族，多个成员在转录水平上既能调控类黄酮代谢产物的生物合成，同时也是木质素合成过程中关键的转录调控因子。但在木本植物中，能同时调控类黄酮及木质素的MYB转录因子目前鲜有报道。　　杨树作为人类生产生活中重要的经济林木，是我国营造人工林的主要树种之一。随着杨树全基因组序列的公布及其遗传转化再生体系的建立，杨树已经成为林木基因组学研究的模式物种，这极大地促进了木本植物的分子生物学和遗传育种研究。前人的研究证实，在杨树基因组中至少存在192个R2R3-MYB转录因子，仅有少数被证实参与了类黄酮化合物或木质素的生物合成，而能同时调控这两个代谢途径的MYB转录因子还未见报道。为此，本研究首先通过生物信息学分析，从杨树基因组中筛选出可能参与苯丙烷类化合物生物合成调控的20个R2R3-MYB转录因子，进一步克隆了转录因子MYB6，利用遗传、生化等实验，在杨树和拟南芥中解析了MYB6对类黄酮和木质素生物合成的调控机制。本论文主要研究结果如下：　　（1）杨树MYB6是一个R2R3-MYB转录激活因子，可能参与了花青素、单宁和木质素生物合成的调控。　　根据已报道的不同植物种中参与苯丙烷类化合物生物合成调控的R2R3-MYB转录因子，将其与杨树基因组中所有的MYB转录因子进行进化分析，获得20个候选R2R3-MYB转录因子，其中杨树MYB6和MYB126与葡萄VvMYB5a及VvMYB5b的亲缘关系最近。前人已证明，这两个转录因子正调控单宁和花青素的合成，同时可抑制木质素代谢途径。进一步氨基酸序列比对分析发现，MYB6与VvMYB5a和VvMYB5b的相似性更高，因此选择MYB6作为本研究的候选基因。采用同源克隆的方法，从毛白杨中克隆到了MYB6基因，该基因编码的蛋白由316个氨基酸组成，具有典型的R2R3结构域和能与bHLH类型蛋白相互作用的保守基序。同时，也克隆了该基因上游1323 bp的启动子片段，启动子元件分析显示该片段含有典型的SMRE（Secondary wall MYB-responsive element）元件。实时定量PCR分析MYB6基因的组织表达特异性，发现该基因在杨树幼叶中表达最高，其次是根和茎。将MYB6启动子片段与GUS报告基因连接，转化毛白杨，GUS染色结果表明，MYB6在杨树的幼叶、根和茎中大量表达，而在成熟叶中表达水平最低，且主要集中于叶脉部位。洋葱表皮细胞中瞬时表达MYB6:GFP融合基因，利用共聚焦显微镜观察GFP信号发现，MYB6定位于细胞核中。酵母转录激活实验证实， MYB6具有转录激活活性。上述结果暗示，杨树MYB6可能是作为一个核定位的转录激活因子，参与了类黄酮和木质素生物合成的调控。　　（2）转基因方法证实MYB6在杨树中能正调控单宁和花青素的合成，同时抑制了木质素的代谢通路。　　为了阐明MYB6的生物学功能，构建MYB6基因超表达和MYB6融合抑制因子MYB6-SRDX表达载体，将其分别转化至野生型毛白杨。与野生型相比，在超量表达MYB6的转基因植株中，其幼叶变红，花青素及单宁含量增加，木质部细胞层数变少，木质部细胞壁变薄，木质素含量降低。超量表达MYB6-SRDX使转基因植株中花青素、单宁和木质素含量均降低。实时定量PCR分析显示，所有转基因植株中花青素、单宁和木质素含量变化与关键酶基因表达量变化趋势一致。这些结果表明，转录因子MYB6可能通过调控关键酶基因的表达，促进了单宁和花青素的生物合成，却抑制了木质素的生物合成，导致转基因植株次生壁的发育受到影响。　　（3）酵母双杂交实验证明MYB6与bHLH及KNAT7能相互作用，MYB6参与互作的关键结构域为R3结构域。　　为了探究MYB6作为转录激活因子，如何实现对杨树木质素生物合成的转录抑制作用。首先去除MYB6的转录激活区段，将其与GAL4-AD蛋白融合构建诱饵质粒，利用酵母双杂交文库，筛选与MYB6相互作用的功能蛋白，结果显示， MYB6能与参与调控花青素合成及表皮毛发育的bHLH转录因子GL3互作，同时发现其也能与转录抑制因子KNAT7互作。荧光双分子互补实验进一步证实，MYB6与GL3和KNAT7在植物细胞中确实能相互作用。已有的研究表明，MYB转录因子与bHLH转录因子相互作用的关键区域位于MYB转录因子R3结构域内部。为搞清MYB6和KNAT7蛋白互作的具体结构域，对其编码的蛋白序列结构特征进行分析后，构建不同长度的基因片段，酵母双杂交方法证明，MYB6与其互作的关键区域位于R3结构域末端。进一步突变MYB6的R3结构域末端，通过酵母双杂交实验证实，突变后的MYB6R3m不能与KNAT7互作，但不影响与GL3的相互作用。这些结果表明 MYB6 可能与 GL3 相互作用最终形成 MBW 复合体（MYB-bHLH-WD40）来调控类黄酮的合成，与KNAT7相互作用来调控木质素的合成进而影响植物次生壁的形成。　　（4）生化实验证明，MYB6与GL3和TTG1形成MBW复合体调控类黄酮合成途径，与KNAT7互作负调控木质素生物代谢通路　　为了验证MYB6调控花青素、单宁和木质素生物合成途径中关键酶基因表达的分子机制，将MYB6和关键酶基因的启动子于烟草细胞中共表达，发现MYB6能激活苯丙烷类化合物合成的上游结构基因PAL1、花青素和单宁合成的关键酶基因DFR2和LAR1、木质素合成的关键酶基因CCoAOMT1的表达。凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）进一步证实，MYB6能结合这些结构基因启动子区域的AC元件，实现转录调控作用。将MYB6、GL3、编码WD40蛋白的TTG1和KNAT7分别与启动子DFR2和CCoAOMT1于烟草细胞中共表达，发现GL3和TTG1的加入可显著增强MYB6对DFR2的调控作用，而对CCoAOMT1的表达也有微弱的增强；而当KNAT7与MYB6共同存在时，MYB6失去了对DFR2表达的转录激活作用，显著增强了对CCoAOMT1表达的转录抑制作用。这些结果表明，MYB6与GL3和TTG1相互作用形成MBW复合体来正调控单宁和花青素的合成，与KNAT7的相互作用可能使MYB6失去转录激活功能，进而转变为转录抑制子负调控木质素的合成，进而影响转基因植株次生壁的形成。　　（5）在拟南芥中通过遗传学方法验证，MYB6负调控木质素的生物合成依赖于与KNAT7的相互作用。　　前人研究已表明，拟南芥MYB75（PAP1）正调控类黄酮生物合成，将其突变后，则出现木质素增多，次生壁加厚的表型，并证实MYB75和KNAT7可以相互作用，而在knat7突变体中次生壁也显著增厚，暗示MYB转录因子可能与KNAT7转录因子协同作用来抑制木质素的合成。因此，选用拟南芥的knat7突变体进一步证实MYB6对植物次生壁形成的影响。将杨树MYB6和MYB6R3m的超表达载体分别转化至野生型拟南芥和knat7突变体中。与野生型拟南芥相比，MYB6-OE转基因株系花序茎中的束间纤维和维管束细胞层数变少，细胞壁变薄；而在MYB6R3m-OE转基因拟南芥中，花序茎中的束间纤维和维管束细胞层数变多，细胞壁变厚。与knat7突变体相比，MYB6-OE/knat7转基因株系花序茎中，束间纤维和维管束细胞层数都变多，细胞壁也都变厚。这些结果说明，MYB6对木质素生物合成的抑制作用依赖于与KNAT7的互作。　　综上所述，在杨树体内，MYB6一方面能与GL3和TTG1形成MBW复合体，激活花青素和单宁合成途径中关键酶基因的表达，从而提高花青素和单宁的含量。另一方面，通过与KNAT7相互作用来抑制木质素合成下游途径中关键酶基因的表达，从而降低木质素含量，进而影响杨树次生壁的形成。最终，MYB6通过与功能特异性的蛋白相互作用，实现对杨树苯丙烷类代谢途径不同支路的调控，并使其处于动态平衡。本论文的研究结果为搞清杨树中MYB转录因子调控苯丙烷代谢通路的遗传机制提供了新的分子证据。

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摘 要

Abstract

第1章文献综述

1.1 植物次生代谢产物

1.1.1 次生代谢物与植物抗病防御反应

1.1.2 次生代谢物与作物品质

1.2 苯丙烷类化合物的生物合成

1.2.1 类黄酮的生物合成

1.2.2 木质素的生物合成

1.3 影响苯丙烷类化合物生物合成的因素

1.3.1 结构基因对苯丙烷类化合物生物合成的影响

1.3.2 转录因子对苯丙烷类化合物生物合成的影响

1.3.3 外界因素对苯丙烷类化合物生物合成的影响

1.4 MYB转录因子

1.4.1 MYB转录因子的结构和分类

1.4.2 MYB转录因子在类黄酮代谢途径中的调控功能

1.4.3 MYB转录因子在次生壁形成中的调控功能

1.5 类黄酮含量变化与木质素含量变化之间的关系

1.5.1 结构基因对类黄酮和木质素之间的含量变化的影响

1.5.2 转录因子对类黄酮和木质素之间含量变化的影响

1.6 杨树的生物学特性及用途

第2章绪论

2.1 选题依据、研究目的与意义

2.2 拟解决的科学问题

2.3 本研究的主要内容

第3章 杨树MYB6对类黄酮和木质素生物合成的影响

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 植物材料

3.2.2 菌种和质粒

3.2.3 试剂及试剂盒

3.2.4 抗生素和激素的配制

3.2.5 培养基的配制

3.2.6 其它试剂

3.2.7 实验仪器和设备

3.3 实验方法

3.3.1系统发生树的构建与序列比对

3.3.2 RNA的提取

3.2.3 RNA的反转录

3.3.3 基因克隆

3.3.4 杨树的遗传转化

3.3.5 CTAB法提取杨树DNA

3.3.6 PCR鉴定转基因杨树

3.3.7 荧光定量PCR

3.3.8 GUS 染色

3.3.9 亚细胞定位

3.3.10酵母表达载体构建和转化

3.3.11 盐酸-甲醇法提取花青素：

3.3.12 单宁含量的测定

3.3.13 木质素含量的测定

3.3.14 单宁的DMACA染色

3.3.15 木质素的甲苯胺蓝染色

3.3.16 石蜡包埋与切片

3.4 结果与分析

3.4.1 R2R3-MYB转录因子的进化分析及同源性比对

3.4.2 杨树MYB6基因表达的组织特异性分析

3.4.3 杨树转录因子MYB6的亚细胞定位及转录活性分析

3.4.4 超量表达MYB6和MYB6-SRDX对杨树花青素合成的影响

3.4.5 超量表达MYB6和MYB6-SRDX对杨树单宁合成的影响

3.4.6 超量表达MYB6和MYB6-SRDX对类黄酮合成途径中关键酶基因表达的影响

3.4.7 超量表达MYB6和MYB6-SRDX对杨树木质素生物合成的影响

3.4.8 转录因子MYB6对杨树木质素合成途径中关键酶基因表达的影响

3.5 讨论

第4章 杨树MYB6对类黄酮和木质素生物合成的调控机制研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 植物材料与培养基

4.2.2 试剂配置

4.2.3 酵母双杂交文库筛选

4.2.4 荧光双分子互补实验

4.2.5 烟草瞬时侵染

4.2.5 GUS报告基因的定量检测

4.2.6 凝胶电泳迁移率实验

4.2.7 酵母表达载体构建

4.2.8 拟南芥的培养

4.2.9 拟南芥的遗传转化

4.2.10 转基因拟南芥单拷贝纯合体的筛选

4.2.11 拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

4.3 结果与分析

4.3.1 酵母双杂交文库筛选与MYB6相互作用的功能蛋白

4.3.2 杨树MYB6与GL3或KNAT7相互作用的验证

4.3.3 杨树MYB6对苯丙烷代谢途径中关键酶基因的调控作用分析

4.3.4 杨树MYB6、GL3和KANT7对苯丙烷代谢途径中关键酶基因的调控作用分析

4.3.5 杨树MYB6和KANT7相互作用的结构域分析

4.3.6 杨树MYB6对拟南芥单宁和花青素合成的影响

4.3.7 杨树MYB6对拟南芥木质素合成的影响

4.3.8 杨树MYB6对单宁、花青素和木质素合成的转录调控模式图

4.4 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2展望

5.3特色与创新

参考文献

附 录

致谢

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