家蚕C8表皮形态突变体相关基因的鉴定与分析

摘要

家蚕（Bombyx mori）属于鳞翅目、蚕蛾科，是鳞翅目昆虫的典型代表。随着家蚕基因组精细图的完成，人们对家蚕的研究正式进入后基因组时代。家蚕有400多种突变品系，其中表皮形态的突变体有枝蚕、竹蚕、石蚕等。对于引起表皮形态突变的基因及调控机制的研究尚处于起步阶段，许多表皮形态突变体的形成机制还有待研究。
　　本研究以一种家蚕表皮形态突变体构建的近等基因系 C8与其回交亲本C108为材料（家蚕C8与其回交亲本C108相比具有几个明显特征：体型细短、表皮硬实等），通过扫描电镜观察 C8与 C108表皮之间的形态结构差异；再以SDS-PAGE结合质谱分析鉴定在C8与C108之间差异表达的表皮蛋白，再通过对其cDNA序列的相似性分析，鉴定可能的突变基因，并用RT-qPCR分析其差异表达模式；进一步对候选基因进行连锁遗传分析，研究结果如下：
　　1．C8表皮外表面上的外突比C108的更为明显，但C8的表皮比较致密，这种致密的表皮结构可能是引起C8表皮硬实的原因。
　　2．利用SDS-PAGE筛选出8条在C8和C108表皮中差异表达的蛋白条带，并通过MALDI-TOF-MS质谱分析获得9个蛋白，其中含有3个表达差异的表皮蛋白：BmCPH34、BmCPG4和BmCPR41，BmCPH34在C8中的表达量高于C108，而BmCPG4和BmCPR41在C8中的表达量低于C108。
　　3．对3个表皮蛋白基因：BmCPH34、BmCPG4和BmCPR41以及前期获得的在C8与C108中差异表达的表皮蛋白基因BmCPR2的cDNA序列进行克隆测序，结果表明：BmCPR2与 BmCPR41基因所编码的氨基酸序列在 C8与 C108以及SilkDB数据库中的P50之间并没有差异；BmCPG4的基因的cDNA序列在C108和P50中存在较大差异，而在C8与P50之间只有1个碱基发生替换，并引起1个氨基酸残基发生突变。推测这3个基因并不是引起C8突变表型的直接因素。与C108和P50相比，BmCPH34基因的cDNA序列在C8中存在15 bp的碱基重复，并有9个碱基的替换，在其编码的氨基酸序列中存在5个氨基酸残基的重复，并引起2个位点的氨基酸的突变。我们推测，BmCPH34基因可能参与C8表皮形态突变的形成。
　　4．利用RT-qPCR技术分别检测这4个表皮蛋白基因在C8与C108之间的表达差异，结果显示：4个表皮蛋白基因在C8中的表达量均高于C108，并且达到差异显著水平，表明这4个表皮蛋白基因在一定程度上参与C8表皮形态突变的形成。进一步对BmCPH34基因的发育时相分析表明该基因主要在家蚕的头、表皮、脂肪体和气管丛中表达，在家蚕幼虫四龄时表达量最高。因此，推测BmCPH34基因与C8表皮形态的形成存在着一定的联系。
　　综上所述，在本研究中，我们共鉴定出4个可能与C8表皮形态突变相关的基因：BmCPH34、BmCPG4、BmCPR2和BmCPR41。但C8表皮形态形成的具体原因还需进一步研究。

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文献综述

1 家蚕基因组

2 家蚕突变体及分子遗传研究进展

3 家蚕表皮形态特征及突变体研究进展

4 家蚕近等基因系及其在家蚕功能基因研究中的应用

1 引 言

1.1 研究目的与意义

1.2 主要内容与技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 形态学观察结果

3.2差异表达蛋白的鉴定分析

3.3差异表达表皮蛋白及其cDNA的序列分析

3.4 差异表达蛋白基因的验证及时空表达分析

3.5 连锁遗传分析

3.6 蛋白互作分析

4 讨 论

5 结 论

参考文献

致谢

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