家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究——家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定及其蛋白定位研究

摘要

微孢子虫(microsporidia)是一类特殊的专性细胞内寄生的单细胞真核生物，能感染几乎所有的动物，包括一些重要的经济昆虫(如蜜蜂和家蚕)和鱼类。甚至，某些微孢子虫可以感染免疫缺陷的病人而导致其腹泻、脑炎和肝炎。在早期研究中微孢子虫被认为是无线粒体的真核生物属于原始的真核生物，但最新研究表明微孢子虫与真菌的亲缘关系较近。由于适应胞内专性寄生，微孢子虫在基因组、细胞结构和代谢水平都高度减缩。特别是微孢子虫的线粒体已经减缩成生化代谢和形态结构简单的纺锤剩体(mitosome)，在人气管普孢虫(Trachipleistophorahominis)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozooncuniculi)和蝗虫微孢子虫(Antonosporalocustae)等细胞内均已鉴定到纺锤剩体。纺锤剩体是由双层膜包裹，结构简单的线粒体源细胞器，不具有许多典型的线粒体代谢途径。微孢子虫纺锤剩体不能通过氧化磷酸化合成ATP，而是利用核苷转运蛋白从细胞质中获得能量分子。尽管纺锤剩体高度减缩，但兔脑炎微孢子虫和人气管普孢虫的纺锤剩体具有组装铁硫簇的功能。微孢子虫纺锤剩体不具有独立的基因组，所有的纺锤剩体蛋白是细胞核内的基因组编码。
　　 关于家蚕微孢子虫(Nosemabombycis)纺锤剩体的研究目前报道较少，也没有纺锤剩体相关蛋白的定位研究。本研究基于家蚕微孢子虫基因组数据库，采用BLAST和HMM方法鉴定了家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因，采用RT-PCR方法调查了这些基因的转录特征，并比较家蚕微孢子虫纺锤剩体蛋白与其它生物纺锤剩体蛋白间的差异；随后，克隆了16个纺锤剩体相关基因，并对其中的两个假定纺锤剩体膜蛋白和两个基质蛋白进行保守性和系统进化研究；采用酿酒酵母表达系统对纺锤剩体相关蛋白进行体外亚细胞定位分析；对4个纺锤剩体相关蛋白进行原核表达并制备抗血清，采用免疫电镜分析它们在家蚕微孢子虫孢子中的亚细胞定位。主要研究如下：
　　 1.家蚕微孢子虫基因组中纺锤剩体相关基因的鉴定及转录特征
　　 下载酿酒酵母线粒体蛋白、阴道毛滴虫氢化酶体蛋白和原虫纺锤剩体蛋白，与家蚕微孢子虫所有蛋白序列进行BLASTP和HMM检索，通过比对在家蚕微孢子虫基因组中检索到26个纺锤剩体相关基因，对应于21个蛋白，其中Nbfrataxin有四个基因拷贝，NbIscU和Nbferredoxin各有两个基因拷贝。10个蛋白参与铁硫簇组装Nbfrataxin、NbNfs、NbIsd11、NbIscU、NbmtHsp70、Nbferrcdoxin、NbFNR、NbGrx5、NbErvl和NbAtml；5个转运蛋白，分别是NbTom40、NbTom70、NbSam50、NbTim22和NbPam16；NbG3PDH参与交替呼吸途径；NbMnsod1和NbMnsod2参与抗氧化呼吸途径；NbNTT1参与能量代谢；NbPDHE1a和NbPDHE1β参与丙酮酸脱羧。与线粒体和氢化酶体蛋白质组相比较，家蚕微孢子虫纺锤剩体蛋白质组比线粒体和氢化酶体更为减缩。反转录PCR结果表明Nbferredoxin、NbTom40和NbTom70在感染后24h检测到转录本，推测3个蛋白在感染的早期(裂殖子时期)扮演重要角色。NbSam50、NbGrx5、NbMnsod1和NbmtHsp70在感染后72h检测到转录本，其余基因在感染后96h才检测到转录本。
　　 2.家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的克隆分析
　　 根据基因组预测序列的开放阅读框，设计16个纺锤剩体相关基因的特异引物，进行PCR扩增、克隆、测序，结果显示所有的克隆序列与基因组预测的完全一致。并对NbmtHsp70、NbNfs、NbTom40和NbNTT1四个重要纺锤剩体蛋白的序列保守性和系统发育关系进行了深入分析：(1)NbmtHsp70，通常被作为纺锤剩体鉴定的标记蛋白，含有其行使功能所需的氨基酸位点：D16、K77、E178、A182、D200、T205、K272、K273和R345；具有2个保守的基序GDAW(V/I)和YSPSQI；与酿酒酵母mtHsp70相比，NbmtHsp70的N-端导肽已丢失，系统进化分析表明NbmtHsp70与线粒体型mtHsp70聚为一类，共同起源于α-变形细菌，进一步支持微孢子虫是真菌的姐妹分支的假说。(2)NbNfs含有典型的半胱氨酸脱硫酶活性所需的氨基酸位点，不具有靶向线粒体的N-端导肽，系统进化分析发现家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶起源于α-变形细菌的groupI家族；(3)NbTom40是纺锤剩体外膜上的主要转运蛋白，与酿酒酵母Tom40相比，蛋白序列高度减缩，但通过三维结构预测仍可以形成19个β折叠组成的桶状结构，在C-端含有β-信号基序，但基序中的极性氨酸酸被甘氨酸替代。系统进化分析表明NbTom40与其他物种的Tom40聚为一类，属于Tom40亚家族，不属于VDACs亚家族。(4)核苷转运体蛋白NbNTTl与质体和细菌的ADP/ATP转运蛋白具有序列相似性，生物信息分析表明NbNTTl预测有12个跨膜结构域，多重序列比对表明其含有K61，E158，D292和K446四个功能位点，与EcNTT3序列有29％的相似性。
　　 3.纺锤剩体相关蛋白在酿酒酵母的定位分析
　　 采用线粒体导肽预测软件：Mitopred、MitPred、Mitoprot、Predotar和PSORTⅡ分析纺锤剩体相关蛋白的N-端导肽，结果显示大部分预测位于基质中的家蚕微孢子虫纺锤剩体相关蛋白都丢失了N-端导肽，仅Nbfrataxin、NbPDHE2a、NbErvl和NbG3PDH具有较短的N-端导肽，在预测的剪切位点-2位存在保守的精氨酸位点。
　　 为了研究纺锤剩体蛋白的定位特征，我们采用酿酒酵母系统表达具有GFP标签的重组蛋白。将除NbG3PDH外16个基因的开放阅读框克隆到酵母表达载体pUG35中，重组质粒转化酿酒酵母CEN.PK2。用SC-Ura平板筛选阳性重组酵母，采用SC-Ura-Met培养基诱导表达融合蛋白，用线粒体探针MitotrackerRed染色。荧光显微镜观察结果显示，参与蛋白转运的NbTom40、NbTom70和NbSam50能够靶向导入酿酒酵母的线粒体，暗示了NbTom40、NbTom70和NbSam50功能与线粒体同源物类似，是纺锤剩体主要的转运蛋白。另外，两个重要的参与铁硫簇组装的蛋白NbNfS和Nbferredoxin也能定位于酿酒酵母的线粒体，说明NbNfs和Nbferredoxin蛋白靶向依赖于其蛋白内部的靶向序列，而且表明家蚕微孢子虫纺锤剩体保留有铁硫簇组装的功能。
　　 4.纺锤剩体相关蛋白在成熟微孢子虫孢子中的免疫定位
　　 我们构建了7个原核表达载体，分别为：NbIscU-pColdI、NbmtHsp70-pET30a、NbTom40-pET30a、NbTom70-pET30a、NbSam50-pET30a、NbNfs-pET30a和NbNTT1-△TM-DHFR-pET30a。重组质粒转化E.coliRosetta后，用1mmol/LIPTG诱导。检测到六个重组蛋白表达，且重组蛋白与预测大小相一致，分别是rmtHsp70、rNbNTT1-△TM-DHFR、rNbIscU、rNbNfs、rNbTom40和rNbTom70，其中4个重组蛋白以包涵体形式表达。采用Ni-NTA亲和层析进行蛋白纯化，获得重组蛋白rmtHsp70、rNbNTT1-△TM-DHFR、rNbIscU和rNbNfs。用4个重组蛋白分别免疫昆明小鼠制备多克隆抗体，免疫印迹结果表明NbNfs、NbIscU和NbNTTl在成熟的孢子中都有表达，而且制备的抗血清特异性高。然而，用重组蛋白rNbmtHsp70制备的抗血清则在成熟的孢子总蛋白中既可以识别NbmtHsp70，也能够识别其它Hsp70家族成员。间接免疫荧光分析表明NbNTT1定位于家蚕微孢子虫的细胞质膜，可能参与从宿主细胞运输能量分子。免疫胶体金定位研究表明NbNfS和NbIscU在成熟的孢子中定位于细胞质中，而NbmtHsp70的胶体金颗粒则呈现两种分布形式，第一种形式为成簇存在，推测是家蚕微孢子虫纺锤剩体的位置，另一种形式为分散于细胞质中，可能是其它Hsp70成员的分布。本研究鉴定了一批家蚕微孢子虫纺锤剩体的相关基因，并对其功能进行了分类，对16个蛋白的表达特征进行了深入分析，完成了4个蛋白的免疫定位，为深入开展纺锤剩体的功能基因组学奠定了基础。