EGFP示踪研究拟态弧菌感染动态过程及菌影的靶向递送特性

摘要

拟态弧菌（Vibrio mimicus）是一种严重危害水产养殖业的病原菌，可引起养殖鱼类腹水病。大量研究表明拟态弧菌可产生黏附素、肠毒素和溶血素等多种毒力因子，但是其感染过程以及宿主主要靶组织尚不清楚。细菌标记技术是使用标记物标记细菌，以实现对目标细菌的识别，从而达到对其定位及示踪的目的。对此，本课题使用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)标记拟态弧菌，通过绿色荧光信号示踪该菌在感染草鱼（Ctenopharyngodon idellus）体内的动态分布，确定其黏附定植与生长繁殖的靶组织，为鱼类腹水病的防控提供科学依据。同时，以pEGFP-N1为模式质粒，巨噬细胞系RAW264.7为APC，对大肠杆菌菌影（Bacterial Ghosts,BG）的装载和靶向递送质粒特性进行验证，为拟态弧菌菌影型基因疫苗的研制奠定基础。本课题具体开展了以下研究工作：
　　1.拟态弧菌的EGFP基因标记及其特性分析
　　将EGFP基因克隆至原核表达载体pBAD24构建重组表达质pBAD24-EGFP，然后电转至拟态弧菌04-14分离菌株的感受态细胞，获得拟态弧菌标记菌株，并分析其情况表达、生长性、黏附致病性等特性。结果显示，该标记菌株经L-阿拉伯糖诱导后，SDS-PAGE显示分子量约为27.0 ku的 EGFP蛋白得到表达；荧光显微镜观察和流式细胞仪检测均发现该标记菌株能够发出明显的绿色荧光信号。与野生菌株相比，标记菌株的形态特征、生长特性、细胞黏附性以及致病性几乎未发生改变，且具有遗传稳定性，表明拟态弧菌标记菌株可用于后续的感染示踪研究。
　　2.拟态弧菌在感染草鱼体内的动态分布
　　用浓度为5×107 CFU/mL的拟态弧菌标记菌株的菌液浸泡感染草鱼5 h。尔后，将感染后草鱼转入饲养水体进行喂养。分别于感染后4、6、8、10、12、24、48、72和85 h，随机剖杀实验组及对照组草鱼各3尾，无菌采集鳃、肝、脾、头肾、肠和肌肉组织并称重，其中一半重量的组织样品置荧光显微镜下观察是否发荧光；另一半重量的组织样品用于检测载菌量。结果发现感染后4h即可在肠道和鳃中检测到绿色荧光信号，标记菌株检出量分别为3.60×108 CFU/g和2.36×106 CFU/g，至10h含量无明显变化，12h后含菌量逐渐下降，但直至鱼死亡肠道比其他脏器均呈现较高的带菌量。感染24h后在头肾、肌肉、肝脏和脾脏中才检测到荧光信号，且载菌量先增加后下降，48h达到峰值，检出量分别为8.75×104CFU/g、9.58×104CFU/g、4.50×104CFU/g和1.50×104CFU/g，均低于肠道中的检出量。结果表明拟态弧菌是一种肠道病原菌，肠黏膜组织是其黏附定植和生长繁殖的靶组织。
　　3.大肠杆菌菌影的装载与靶向递送质粒特性的验证
　　将携带温控裂解质粒pBV220-E的重组大肠杆菌DH5α菌株于28℃培养至对数期，这时迅速将培养温度升至42℃，以诱导裂解基因E表达，裂解细菌，制备菌影（BG）。扫描电镜和透射电镜观察到BG保持细菌原有的形态与膜结构，但是细胞表面出现明显的跨膜溶菌孔道，内部基本不含内容物。将BG与质粒pEGFP-N1按不同浓度比例共同孵育后加入膜囊封闭过夜，置于流式细胞仪检测装载效率。随后，在最佳装载条件下，将载有pEGFP-N1的BG转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7，激光扫描共聚焦显微镜观察和流式细胞仪检测吞噬效率和蛋白表达情况。结果显示BG和质粒pEGFP-N1浓度比为5:2时，装载效率、吞噬效率和蛋白表达率分别为90.13％、98.47%和40.74%，表明BG具有良好的装载和靶向递送质粒的特性。
　　综上所述，本研究明确了鱼类肠黏膜组织为拟态弧菌黏附定植与生长繁殖的靶组织，证实大肠杆菌菌影具有良好的装载和靶向递送质粒的特性，可作为基因疫苗的靶向递送载体。

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文献综述

1 拟态弧菌研究进展

2 绿色荧光蛋白研究进展

3 菌影作为递送载体的研究进展

4 总结与展望

引言

1材料与方法

1.1菌株、质粒与细胞

1.2酶类与主要试剂（盒）

1.3主要培养基与溶液的制备

1.4 实验动物

1.5 主要仪器

1.6拟态弧菌的EGFP基因标记及其特性分析

1.7 拟态弧菌在感染草鱼体内的动态分布

1.8大肠杆菌菌影的装载与靶向递送特性检测

2 结果与分析

2.1重组表达质粒pBAD24-EGFP的构建

2.2 拟态弧菌标记菌株的鉴定

2.3 拟态弧菌标记菌株的特性分析

2.4 拟态弧菌在感染草鱼体内的动态分布

2.5大肠杆菌菌影的制备与鉴定

2.6 大肠杆菌菌影的装载效率

2.7 巨噬细胞对菌影的吞噬效率

2.8 质粒pEGFP-N1在巨噬细胞的表达情况

3 讨论

3.1 拟态弧菌标记菌株的构建

3.2拟态弧菌在感染草鱼体内的动态分布

3.3 菌影装载基因疫苗并靶向APC进行表达的可行性分析

结论

参考文献

附录

致谢

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