溶藻弧菌菌影制备方法改良及菌影对凡纳滨对虾免疫保护机理的研究

摘要

随着凡纳滨对虾养殖密度的提高和抗生素的滥用，依赖传统的治疗手段治疗由溶藻弧菌引发的疾病越来越难，急需新型的治疗手段。本论文利用分离的溶藻弧菌及其噬菌体，制备溶藻弧菌菌影；利用福尔马林制备溶藻弧菌灭活疫苗；通过酚水法提取溶藻弧菌的脂多糖。将这三种制剂通过注射或投喂的方法免疫凡纳滨对虾，观察其对凡纳滨对虾抗病力的影响。主要研究内容和结论如下：
　　1.从湛江市水产品批发市场下水道水体中分离了一株弧菌，经生化鉴定和toxR基因高变区PCR分子鉴定，确认该菌为溶藻弧菌。
　　2.以分离的溶藻弧菌为宿主菌，从湛江水产品批发市场下水道污水中分离到一株溶藻弧菌噬菌体。该株噬菌体形成的噬菌斑直径为1-1.5mm(12h)，对紫外线敏感，暴露在紫外灯(20W，30cm)下30min可丧失全部裂解活性；在pH8-11范围内裂解活性较强，最适pH值为11；裂解周期为65min；对65℃以上的高温敏感；对乙醚和氯仿有较好的耐受性；对抗病毒药物阿昔洛韦敏感；其最大常规稀释度为106PFU/mL；最佳感染复数为10。
　　3.向培养12h的菌液中加入福尔马林，使其终浓度分别为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％，将混合液分别静置于4℃、25℃、35℃环境下以及25℃时放置于回旋振荡器中摇瓶灭活，再涂平板检测灭活效果。筛选出比较理想的灭活条件为：在25℃时使用浓度为0.1％的福尔马林摇瓶灭活12h。用酚水法提取溶藻弧菌脂多糖，产率为0.7529％，得到的脂多糖样品蛋白含量为22.1μg/mg，多糖含量为190.7μg/mg。向体重为7-9g的凡纳滨对虾分别注射浓度为5mg/mL，4mg/mL，3mg/mL，2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL，的LPS溶液，每尾注射量为0.1mL，当该LPS浓度超过3mg/mL时就具有致死作用。
　　4.溶藻弧菌噬菌体菌影的制作方法：将培养12h的溶藻弧菌用无菌海水洗涤，将其和噬菌体浓缩液按感染复数MOI=10的比例加入到无菌海水中反应6h。利用细菌数量与其破碎时释放于上清液中的核酸含量成线性关系的原理，得到直线方程y=8E+06x-4E+06，在核酸浓度为2.5-9.7μg/mL的范围内，线性关系良好，可以将其作为计算菌影浓度的一种方法。以1:1的比例向菌影悬液中加入大蒜提取液反应3.5h，可除去残余活菌，用PBS多次洗涤，即可得到溶藻弧菌噬菌体菌影。
　　5.以注射菌影、灭活疫苗、LPS以及投喂菌影的方式免疫凡纳滨对虾。在不同的受免时间攻毒。结果显示：将菌影以1×107cells/mL的浓度注射免疫凡纳滨对虾，在受免后的24h内免疫保护率较强，在受免后的12h时免疫保护率最强，达到53.56％：3者差异不显著(P>0.05)；将疫苗以1×107cells/mL的浓度注射免疫凡纳滨对虾，在受免后48h，免疫保护率最大为57.14％；将LPS以0.5mg/mL的浓度注射免疫凡纳滨对虾，在受免24h时达到最大免疫保护率为57.14％。
　　投喂菌影免疫凡纳滨对虾后，免疫保护率可随受免时间的延长而提高，YT2在免疫48h后，免疫保护率达到28.57％。
　　6.通过对血淋巴细胞比例、血清酚氧化酶活力以及血淋巴细胞吞噬率的观察，菌影和疫苗通过促使G细胞的增生而提高PO活力。LPS通过促进SG细胞增生而提高PO活力，高浓度(2mg/mL)的LPS可以提高PO活力，但同时也会有较强的毒害作用。
　　7.LPS对凡纳滨对虾超氧化物歧化酶活力的促进效果不如菌影和疫苗。
　　8.菌影能够提高凡纳滨对虾的非特异性免疫力。