禽致病性大肠杆菌ybjX、pagp缺失株生物学特性及其与PhoP的相关性研究

摘要

PhoP/Q二元调控系统广泛存在于禽致病性大肠杆菌中，其可通过调控与内毒素(LPS)相关基因的表达诱导应答基因的防御性表达。而应答基因的表达水平与APEC的自身致病力有很大关系。抗抗菌肽基因(AMPR)通过直接或间接修饰LPS，改变细菌的外膜结构加强细菌抵抗宿主抗微生物因子的渗透能力，从而有助于对抗菌肽的抵抗。
　　本研究在前期基因芯片的基础上筛选出可能与抗抗菌肽相关的基因ybjX、pagp，探究ybjX、pagp基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性及两个基因与PhoP相关性的研究。通过引物设计，PCR扩增结果表明，成功克隆出菌株中的ybjX、pagp序列并利用Red同源重组系统成功构建ybjX、pagp缺失株。在此基础上利用质粒pSTV28a构建了基因回复株。并对AE17与ybjX、pagp基因缺失株和回复株的生物学特性展开研究。在了解ybjX和pagp缺失对其生物学研究的基础上进一步研究ybjX，pagp受PhoP的调控机制、以及对阳离子抗菌肽的抗性。具体研究内容和结果如下:
　　1.禽致病性大肠杆菌ybjX和pagp基因缺失株及回复株的构建
　　AE17（对氯霉素和氨苄青霉素敏感）为本实验室保存的O2血清型禽致病性大肠杆菌菌株。本实验利用Red同源重组技术对分别对ybjX基因和pagp基因进行缺失，成功构建两株单基因缺失株（△ybjX和△pagp）并使用低拷贝质粒pSTV-28a对两株基因缺失株进行基因回复，成功构建基因回复株CybjX、Cpagp。
　　2.ybjX和pagp基因缺失其生物学特性的评价
　　本实验通过生长曲线的测定、运动性能力的检测、环境耐受试验和生物被膜形成能力检测、外膜渗透性试验、CEF细胞黏附和入侵试验和LD50的测定，探索pagp和ybjX基因缺失株对APEC生物学特性的影响。在LB液体培养基中的生长性能ybjX基因缺失株和回复株较野生株未发生明显改变;而相同条件下pagp基因缺失株和野生株生长性能比较发生明显改变。运动性能力的检测结果表明ybjX和pagp基因的缺失未能影响AE17的运动性能力。环境耐受试验表明ybjX、pagp缺失株对酸性环境的抵抗力较野生株分别降低2.2倍(p＜0.05)，4倍(p＜0.01);ybjX、pagp缺失株对碱环境的耐受力较野生株分别降低1.5倍、降低2倍(p＜0.05);ybjX、pagp缺失株对热环境的耐受力降低10.4％(p＜0.01);pagp缺失株对热环境的抵抗力较野生株降低19.2％;生物被膜实验结果显示ybjX缺失株生物被膜形成能力显著降低是野生株的0.75倍(p＜0.01);结果表明与野生株相比，pagp缺失株生物被膜形成能力显著增强是野生株的1.4倍(p＜0.01)。
　　NPN试验考察了两个缺失株的细胞外膜渗透性。结果表明这两个基因的缺失都能使APEC外膜渗透性增强。对APEC突变株的抗生素最小抑菌浓度和渗透性实验结果较吻合。外膜渗透性较高的菌株对多粘菌素B和AVBD2表现出的敏感性较高。
　　本试验通过对CEF细胞黏附和入侵能力的比较、LD50的测定探索了ybjX和pagp基因缺失株对APEC致病力的影响。对鸡胚成纤维细胞的黏附和入侵结果显示，实验结果表明ybjX缺失株对鸡胚成纤维细胞的黏附、入侵能力能力与野生株相比分别降低了2.3倍、2倍(p＜0.01);pagp缺失株对鸡胚成纤维细胞的黏附、入侵能力能力与野生株相比均升高了1.3倍(p＜0.01)（而互补株的黏附入侵能力则恢复到野生株水平）。半数致死量检测结果显示，对7日龄罗曼鸡的半数致死量检测结果表明ybjX和pagp缺失株对鸡的致病力均下降。
　　3.禽致病性大肠杆菌ybjX和pagp基因与PhoP蛋白的相关性分析
　　重组BL21-pET32a/phoP表达重组蛋白鉴定分子量为42.9KDa与其理论分子量相一致。并对表达的蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化进行纯化。
　　在Genbank上查找APEC O1血清型的ybjX和pagp基因序列，利用Promoter prediction网站，预测ybjX、pagp两个基因对应的启动子序列，利用EMSA验证PhoP蛋白是否能够结合上述两个基因的启动子。研究结果显示ybjX、pagp受phop蛋白的间接调控。
　　4.AE17与ybjX和pagp缺失株对阳离子抗菌肽抗性的比较
　　本研究比较野生株、ybjX和pagp缺失株对多粘菌素B、AVBD2的敏感性。记录抑菌圈的直径结果表明两个缺失株对多粘菌素B、AVBD2的抵抗能力都显著降低。
　　通过以上实验成功构建APEC ybjX和pagp单基因缺失株，结果显示ybjX和pagp基因的缺失对CEF细胞和机体致病力均下降。证明了PhoP调控子对ybjX和pagp不能直接调控;ybjX和pagp缺失使AE17对抗菌肽的敏感性增强。初步证明了这些基因在禽致病性大肠杆菌中极可能参与抵抗宿主的先天性免疫防御，对生长代谢等的调控，如脂多糖的合成，细胞膜的形成以及药物敏感性等。研究结果表明ybjX和pagp基因对APEC的致病力及对抗菌肽的抵抗具有重要的影响，为深入研究APEC抵抗宿主先天性免疫防御机理奠定一定的研究基础。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

英文缩写词表

文献综述

引言

1 材料与方法

1．1 试验材料与仪器

1．1．1 试验材料

1．1．2 试验动物

1．1．3 主要试剂及试剂盒

1．1．4 试剂的配制

1．1．5 仪器设备

1．2 实验方法

1．2．1 ybjX、pagp基因的测序及序列分析

1．2．2 ybjX、pagp基因缺失株的构建

1．2．3 ΔybjX、Δpagp回复株的构建

1．2．4 缺失株和回复株的生物学特性的检测

1．2．5 重组PhoP蛋白的诱导表达纯化

1．2．6 禽致病性大肠杆菌ybjX、pagp基因与PhoP蛋白的相关性分析

1．2．7 AE17、ybjX、pagp缺失株对多粘菌素B及AVBD2抗性的比较

2 结果与分析

2．1 ybjX、pagp基因缺失株和回复株的鉴定

2．1．1 ybjX、pagp基因的鉴定

2．1．2 ybjX、pagp缺失株的鉴定

2．1．3 回复株CybjX、Cpagp的鉴定

2．2 缺失株和回复株生物学特性

2．2．1 生长曲线的测定

2．2．2 运动性能力的检测

2．2．3 环境耐受力检测

2．2．4 生物被膜形成能力检测

2．2．5 基因缺失对外膜渗透性的影响

2．2．6．AE17、ΔybjX、Δpagp对CEF细胞黏附入侵能力的比较

2．2．7 半数致死量(LD50)检测

2．3 PhoP蛋白的表达纯化及与ybjX，pagp相关性分析

2．3．1 表达载体pET32a-phoP的鉴定

2．3．2 重组PhoP蛋白的IPTG诱导表达

2．3．3 重组PhoP蛋白的Ni-NTA纯化

2．3．4 禽致病性大肠杆菌PhoP蛋白与ybjX、pagp相关性检测

2．4 AE17和缺失株对AVBD2的抗性分析

3．讨论

3．1 APEC中ybjX和pagp基因的缺失和回复

3．2 ybjX和pagp基因的缺失对APEC生物学特性的影响

3．3 禽致病性大肠杆菌ybjX和pagp基因与PhoP蛋白的相关性分析

3．4 APEC基因的缺失对抗菌肽的抗性分析

4 结论

参考文献

个人简介

附作者在读研期间发表的学术论文