马齿苋/鱼腥草-益生菌联用对热毒证小鼠腹泻的预防效果研究

摘要

畜禽腹泻是危害养殖业的重要疾病之一。具有几千年历史的中医药是中国的瑰宝，在人和动物疫病防治中发挥了重要作用。中兽药的天然性、低残留性和低抗药性是化学药物所无法比拟的，是绿色健康养殖的必然发展趋势;益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，通常被用来治疗与胃肠道相关的疾病。有资料表明，有些中药与益生菌联用治疗肠道疾病效果优于单独使用中药或益生菌。为此，本研究尝试将具有清热解毒作用的中药马齿苋、鱼腥草分别与益生菌联合应用预防动物腹泻性疾病，为中药与益生菌联用技术提供有益探索。
　　本研究以小鼠为实验动物，马齿苋、鱼腥草为试验药物，56株益生菌为受试菌株，进行以下几个方面的试验:(1)益生菌筛选。通过体外试验筛选出可以耐受人工胃肠液、抑制产肠毒素性大肠杆菌、并且能够在马齿苋或鱼腥草水提液中生长的益生菌。(2)动物试验。首先制备含药饲料，即将1、2.5、5g/kg三个剂量的马齿苋、鱼腥草分别添加到小鼠基础日粮中，制备与正常小鼠饲料形态相同含药颗粒饲料;然后进行试验动物的分组及处理。将240只昆明种雄性小鼠随机分为15组，包括不同剂量马齿苋(1、2.5、5g/kg)组、不同剂量马齿苋(1、2.5、5g/kg)+益生菌组、不同剂量鱼腥草(1、2.5、5g/kg)组、不同剂量鱼腥草(1、2.5、5g/kg)+益生菌组、益生菌组、模型组、空白组。其中各组益生菌浓度均为1.0×108CFU/mL,灌胃剂量0.2mL/10g体重，1次/d。试验期间，空白组小鼠给予普通饲料，其它组小鼠喂饲相应含药饲料或灌胃益生菌。(3)构建小鼠腹泻模型。试验组小鼠连续饲喂含药饲料或灌胃益生菌10d后，以0.28mL/10g体重的剂量灌胃的干姜水提液(0.5g/mL)，1次/d，连续10d;再以0.2mL/10g体重的剂量腹腔注射7.5×107CFU/mL的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，1次/d，连续3d。(4)试验观察与检测。试验期间记录小鼠精神、体重及腹泻发生情况，试验结束时采集血液进行生化检查，采集肠道组织进行病理学检查及组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1、IFN-γ等炎症因子表达情况检查。具体试验结果如下:
　　(1)益生菌筛选从56株益生菌中筛选出了7株能够耐受人工胃肠液环境的益生菌，分别为3株酵母菌、2株乳酸菌、2株枯草芽孢杆菌;通过马齿苋、鱼腥草对益生菌的协同实验以及益生菌对ETEC的抑制实验，进一步从上述7株益生菌中筛选出3株能在马齿苋、鱼腥草水提液中生长良好且能抑制ETEC生长的益生菌，分别为1株酵母菌、1株乳酸菌、1株枯草芽孢杆菌。
　　(2)腹泻率统计模型组小鼠在攻菌24h后的腹泻率高达87.5％，远远高于其他用药组;鱼腥草各用药组的腹泻率普遍高于同等剂量的马齿苋各用药组;比较各马齿苋用药组发现，高剂量马齿苋+益生菌组小鼠的腹泻率最低(12.5％)。
　　(3)组织病理学检查组织学检查发现，模型组小鼠小肠绒毛断裂、部分坏死脱落、肠腺变形明显，提示小鼠腹泻模型建造成功。预防后，与模型组相比，不同剂量马齿苋组、不同剂量马齿苋+益生菌组以及益生菌组小鼠十二指肠病理变化有所恢复，其中高剂量马齿苋+益生菌组小鼠肠绒毛基本完整，肠道组织结构趋于正常。
　　(4)电解质指标测定与空白组相比，模型组小鼠血清中C1-显著升高(P＜0.05)，Ca2+含量显著降低(P＜0.05);与模型组相比，各用药组小鼠均能在一定程度上恢复小鼠生理机能，其中高剂量马齿苋+益生菌组的效果优于其他用药组。
　　(5)肠道炎症因子检测与空白组相比，模型组TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6、TGF-β1、IFN-γ表达均显著升高(P＜0.05);与模型组比较发现，高剂量马齿苋+益生菌组IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1、IL-10的表达量均显著降低(P＜0.05)。
　　结论:(1)ETEC配合干姜水提液诱导的小鼠腹泻，可造成小鼠体内电解质平衡失调和肠道损伤;(2)马齿苋、鱼腥草与益生菌联合应用都能降低热毒腹泻小鼠的腹泻率，其中马齿苋-益生菌联用的效果优于鱼腥草-益生菌联用;(3)马齿苋与益生菌联合应用能恢复热毒小鼠的电解质平衡，可通过改变IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1、IL-10炎症因子减轻肠道炎症反应。

目录

声明

致谢

摘要

图表目录

英文缩写词

文献综述

引言

1 材料与方法

1．1．4 主要仪器与设备

1．2 方法

1．2．3 3种益生菌菌液对ETEC的抑制作用

1．2．4 3种益生菌代谢产物对ETEC的抑制作用

1．2．9 含药饲料的制备

1．2．11 动物分组及处理

1．2．12 电解质指标测定

1．2．13 病理组织切片制作

1．2．14 荧光定量PCR检测肠道炎症因子

1．2．15 统计学分析

2 结果

2．1 3种益生菌的人工胃肠液耐受性试验结果

2．2 3种益生菌对ETEC的抑制试验结果

2．3 马齿苋／益生菌对ETEC的抑制作用

2．4 3种益生菌标准曲线的绘制

2．5 马齿苋／鱼腥草对7株益生菌增殖的影响

2．6 马齿苋、鱼腥草与3种益生菌联用对小鼠腹泻率的影响

2．7 马齿苋与3种益生菌联用对小鼠电解质指标的影响

2．8 肠道组织病理学变化

2．9 肠道炎症因子的检测结果

2．9．1 RT-PCR对目的基因的扩增曲线和溶解曲线

2．9．2 肠道炎症因子的相对表达量

3 讨论

3．1 益生菌筛选

3．2 马齿苋、鱼腥草对益生菌和大肠杆菌的作用

3．3 腹泻模型的构建

3．4 马齿苋／鱼腥草与3种益生菌联用对小鼠腹泻的影响

3．5 马齿苋与3种益生菌联合应用对腹泻小鼠生化指标的作用

3．6 马齿苋与3种益生菌联合应用对小鼠肠道炎症因子的作用

3．7 有待进一步研究的问题

3．8 本研究创新点

4 结论

参考文献

作者简介