皖东牛白细胞GPR54差异表达与相关基因转录水平关联性研究

摘要

GPR54基因变异会影响牛初情期启动，本研究采集皖东牛（22头）血液样品，提取皖东牛血液白细胞总RNA，通过对样本牛血液GPR54调控区SNPs检测，多态片段基因型鉴定，通过实时荧光定量PCR分析不同基因型GPR54表达水平，采用RNA-Seq技术分析不同基因型牛GPR54与初情期相关基因转录水平及信号通路之关联性。结果表明:
　　1.检测出皖东牛GPR54基因启动子区SNPs，获得2个位点，基因型组合分别为CCTT（A组）、CTTC（B组）和TTCC(C组)。
　　2.不同基因型牛的GPR54基因表达水平显示为CCTT＞CTTC＞TTCC。CTTC型GPR54基因表达水平介于两个纯合型之间。
　　3.由RNA-seq技术共测了8个样品，平均产生了24136079条原始reads，clean reads平均数目为23739830。与参考基因和参考基因组比对，得出clean reads的平均比对率为分别是59.97％和91.22％。
　　4.通过RNA-seq检测，A（CCTT型）组和B组（CTTC型）共测得差异基因16719个，其中上调基因6778个，下调基因9920个。通过对差异基因筛选结果进行分析，发现大量与初情期启动相关的基因。如对青春期启动具有抑制作用的GABA、NPY;兴奋性因素有胶质细胞分泌的TGF和IGF，以及GPR54/Kiss-1;另外还有雌激素受体基因(ER)和性激素结核球蛋白基因(SHBG)都与初情期启动相关。
　　5.通过对差异基因Pathway分析，选择2个富集的通路，包括GnRH信号通路和Estrogen信号通路。分析位于该信号通路的差异基因，发现CaM基因显著下调(P＜0.05)。

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致谢

摘要

图表目录

英文缩略词表(Abbreviation)

文献综述

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验牛

2．2 牛血液基因组DNA的提取

2．2．1 DNA的提取

2．2．2 DNA的检测

2．3 血液白细胞RNA提取

2．3．2 RNA检测

2．4 PCR扩增与多态性检测

2．4．1 引物设计

2．4．2 PCR反应

2．6 RNA-seq技术文库构建

2．7 RNA-seq信息分析

2．7．1 数据过滤

2．7．2 数据比对

2．7．3 基因定量

3 结果与分析

3．1 样品与目的基因验证结果

3．1．1 DNA提取检测结果分析

3．1．2 牛血液RNA检测

3．1．3 目的基因PCR扩增结果分析

3．1．4 目的片段的序列及启动子基因型

3．2 不同启动子型与牛GPR54基因表达水平的关联性

3．3 与初情期相关基因RNA-seq检测分析

3．3．2 RNA-seq测序饱和度和随机性

3．3．3 RNA-seq测序基因定量分析

3．3．4 RNA-seq测序样品间的相关性

3．3．5 相关基因的差异表达

3．3．6 相关信号通路差异分析

4 讨论

4．1 试验牛

4．2 牛初情期启动与GPR54基因多态性关系

4．3 GPR54基因表达调控

4．4 与GPR54相关的基因表达差异

5 结论

参考文献

作者简介