超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞协同抑制作用的实验研究

摘要

目的：利用超声介导载紫杉醇微泡及载siRNA微泡，进行药物靶向释放，用于治疗宫颈癌的实验研究。通过自制高分子材料PLGA为外壳，包裹紫杉醇及针对HPV16E6、E7特异性的siRNA，制备载药、载siRNA微泡，在体外作用于宫颈癌细胞，初步评价超声介导载紫杉醇及载 siRNA微泡联合应用对宫颈癌的协同抑制效果，为进一步临床应用研究提供实验依据。　　方法：⑴利用改良型双乳剂挥发法和低温真空干燥技术，自制出载紫杉醇和载siRNA的PLGA超声微泡。⑵选择宫颈癌Caski细胞进行培养，使用不同浓度的紫杉醇作用于宫颈癌Caski细胞，探索其对宫颈癌Caski细胞体外抑制的最佳浓度，作为制作超声微泡时紫杉醇的浓度标准。⑶根据siRNA的设计的基本规则，合成靶向于 HPV-16之E6、E7的 siRNA，进而转染宫颈癌Caski细胞，通过DAPI细胞染色确定相关siRNA对宫颈癌Caski细胞的抑制作用。⑷通过MTT比色法摸索出超声辐照击破本实验合成的PLGA微泡的时间强度最适宜参数，作为未来实验超声辐照的参数。⑸实验将宫颈癌Caski细胞分为四组：空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组、联合载紫杉醇及载siRNA微泡组。按照最佳参数给予相同频率及时间强度的超声辐照，48小时后，进行MTT试验，WB检测凋亡蛋白、FCM检测细胞凋亡率及细胞周期的改变，评价超声介导载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡对宫颈癌细胞协同抑制作用的效果。　　结果：①通过改良型双乳剂挥发法和真空冷冻干燥技术，制备出载紫杉醇和载siRNA的PLGA超声微泡，形态规则呈球形，粒径分布均匀，包封率达到89.58％，载药率达到11.86%，达到进一步实验的要求。②使用不同浓度的紫杉醇进行抑制宫颈癌Caski细胞增殖的体外实验，明确了10-6mol/L浓度的紫杉醇对宫颈癌Caski细胞体外抑制的效果最佳。③寻找并合成了靶向于 HPV-16之E6、E7的 siRNA，通过DAPI细胞染色验证了其对宫颈癌Caski细胞增殖有良好抑制作用。④通过MTT比色法探索超声辐照击破本实验自制PLGA微泡的参数，采用频率1.5W/cm2，辐照35s时，其效果最佳。⑤与空白对照组相比，载紫杉醇微泡组宫颈癌Caski细胞增殖受到一定程度抑制，载siRNA微泡组宫颈癌Caski细胞增殖有一定抑制，联合载紫杉醇及载siRNA微泡组宫颈癌Caski细胞增殖的抑制作用更加明显，其Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表达上调明显，Bcl2抑凋亡蛋白下调明显，流式细胞仪检测其细胞凋亡率更高。　　结论：⑴自制PLGA超声微泡，其形态、粒径分布、包封率、载药率达到实验要求。⑵体外实验表明，超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞分别有一定的抑制作用，两者联合应用，其协同抑制宫颈癌Caski细胞增殖的效果更好。本实验研究结果为临床上探索宫颈癌治疗提供了一种新的思路。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略词

引言

材料与方法

1.1 试验相关材料

1.1.1主要仪器和设备

1.1.2相关试剂与材料

1.1.3相关试剂的配制

1.2 实验方法

1.2.1 PLGA载紫杉醇超声微泡的制备

1.2.2 PLGA载siRNA超声微泡的制备

1.2.3 紫杉醇标准曲线的绘制及载药微泡的包封率及载药率的测量

1.2.4 Caski细胞的培养 (贴壁细胞）

1.2.5 Caski细胞复苏与冻存 (贴壁细胞）

1.2.6 MTT法探索最适宜的体外抑制Caski细胞的紫杉醇浓度

1.2.7 MTT 法探索最适宜的超声辐照时间

1.2.8 siRNA转染Caski细胞

1.2.9 DAPI染色验证转染后的Caski细胞的凋亡情况

1.2.10实验分组

1.2.11 Western Blotting实验流程

1.2.12流式检测细胞凋亡

1.2.13流式检测细胞周期

1.2.14统计学分析

结果

第一部分 高分子 PLGA 载紫杉醇微泡及载 siRNA 微泡的成功制备及相关特性检测

1.1 成功制备出PLGA载紫杉醇微泡及载siRNA微泡：

1.2自制高分子PLGA超声微泡的形态观察：

1.3自制高分子PLGA超声微泡的粒径分布情况：

1.4自制高分子PLGA超声微泡的包封率与载药率

第二部分 超声介导超声微泡辐照参数的优化及紫杉醇体外抑制宫颈癌细胞增殖的最适宜浓度的选择

2.1超声介导的微泡辐照时间的选择

2.2 紫杉醇体外抑制宫颈癌细胞增殖的最适宜浓度的选择

2.3 设计合成靶向于HPV16病毒E6、E7基因的siRNA，DAPI染色验证转染后的Caski细胞的凋亡情况

第三部分 超声介导载紫杉醇微泡联合载 siRNA 微泡对宫颈癌细胞协同抑制作用

3.1 Western Blotting检测Bax、Caspase3、Bcl2三种凋亡蛋白的表达

3.2 流式细胞术分析联合微泡对细胞周期的影响

3.3 流式细胞术分析联合微泡对细胞凋亡的影响

讨论

小结

参考文献

综述:超声介导超声微泡治疗宫颈癌的研究进展

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著