脂类小分子ETI对γ-分泌酶活性调控作用的研究及该酶新底物AXL剪切位点的发现

摘要

研究目的：　　（1）研究生物活性脂类及其类似物对γ-分泌酶的活性调控作用，以期筛选出抑制效果较好的γ-分泌酶抑制剂（γ-secretase inhibitor，GSI），并初步探讨其作用机制，为阿尔茨海默症（Alzheime's disease，AD）的新型药物治疗提供实验基础；　　（2）通过研究γ-分泌酶对新底物AXL的剪切作用，确定其对AXL的剪切位点，为γ-分泌酶的剪切机制以及确定AXL剪切产物提供理论基础；　　研究方法：　　（1）体外表达并纯化γ-分泌酶的底物C100（APP截短形式）、N100（Notch的截短形式）；表达γ-分泌酶的四个亚基，并提取γ-分泌酶纯酶；　　（2）建立γ-分泌酶体外酶切模型，通过剪切产物AICD/NICD的积累量来判断γ-分泌酶的活力；　　（3）测试脂类物质ETI对γ-分泌酶的调节作用，Western blot检测剪切产物AICD/NICD的表达量；Wiltfang blot检测Aβ40、Aβ42的表达量；　　（4）采用磷脂竞争实验及分子模拟初步阐述ETI对γ-分泌酶的作用机制；　　（5）设计引物并进行PCR，将野生型AXL跨膜区中相应位置的氨基酸进行定点突变，经过抗性筛选出单克隆，扩大培养并提取质粒后进行DNA测序，确定突变成功；　　（6）将突变后的AXL质粒转染到HEK293T细胞中，加入γ-分泌酶抑制剂处理过夜，裂解细胞，用Western blot检测底物CTF的积累情况，间接判断γ-分泌酶对AXL的剪切作用。　　实验结果：　　（1）以pET-21b为载体，成功提取了γ-分泌酶相关底物N100、C100；培养稳转了γ-分泌酶PS1、PEN2-Flag、Aph1-HA、NCT-V5/His四个亚基的S20细胞，并提取了γ-分泌酶；　　（2）通过体外酶活测试发现了一种长链脂肪酸类似物二十碳三炔酸（5，8，11-Eicosatriynoic acid，ETI）对γ-分泌酶具有抑制作用，并在细胞水平验证其对γ-分泌酶同样具有抑制效果；　　（3）探讨了以底物N100、C100为研究对象时ETI对γ-分泌酶的作用效果。发现以C100为底物时，ETI对γ-分泌酶的抑制效果明显，而以N100为底物时，ETI对γ-分泌酶的活性没有影响；　　（4）磷脂竞争实验表明高浓度的磷脂分子能够减弱或抵消ETI对γ-分泌酶的抑制作用，而低浓度的磷脂分子不能影响ETI对γ-分泌酶的抑制作用；通过分子模拟，预测了ETI与γ-分泌酶相互作用机制，发现ETI与γ-分泌酶亚基存在结合位点；　　（5）AXL跨膜区单个氨基酸突变或缺失后γ-分泌酶对底物AXL依然发挥剪切作用；AXL跨膜区靠近胞内的6个氨基酸突变后γ-分泌酶对底物AXL依然发挥剪切作用；当靠近胞外的前8个氨基酸和靠近胞内的后6个氨基酸均突变后，γ-分泌酶对底物AXL不能发挥剪切作用；而仅对AXL跨膜区靠近胞外的前8个氨基酸突变，γ-分泌酶对底物AXL仍不能发挥剪切作用；　　（6）仅突变跨膜区上述前8个氨基酸中的前4个或者后4个氨基酸后，γ-分泌酶依然能够对底物AXL进行剪切。　　结论：　　（1）一种含有20个碳原子及3个碳碳三键的长链脂肪酸类似物二十碳三炔酸（5，8，11-Eicosatriynoic acid，ETI）对γ-分泌酶有选择性抑制作用，并能同时抑制γ-分泌酶剪切产物Aβ40、Aβ42的产生。ETI可能通过置换γ-分泌酶复合物中的两个磷脂分子而抑制其酶活力；　　（2）γ-分泌酶能够识别并剪切底物AXL，其剪切位点位于AXL跨膜区靠近胞外的前8个氨基酸，且剪切位点有多个。

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英文缩略词表

引言

第一部分脂类小分子ETI对γ-分泌酶活性调控作用的研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法及步骤

2实验结果：

2.1 S20稳转细胞株中γ-分泌酶各组分的表达量

2.2 γ-分泌酶纯酶各组分表达量

2.3 γ-分泌酶底物N100的表达与纯化

2.4 γ-分泌酶体外酶活模型测试

2.5 以APP来源的蛋白截短形式C100为底物时，ETI对γ-分泌酶活力的影响

2.6以Notch来源的蛋白截短形式N100为底物时，ETI对γ-分泌酶活力的影响

2.7 ETI对不同Aβ多肽的影响

2.8在细胞水平ETI对γ-分泌酶抑制效果

2.9 ETI与PC的化学结构的分析

2.10 不同浓度的PC含量对ETI抑制作用的的影响

2.11 ETI与γ-分泌酶相互作用的分子模型

3讨论

第二部分γ-分泌酶对新底物AXL剪切位点的研究

1材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法及步骤

2实验结果：

2.1 AXL跨膜区相应氨基酸突变后PCR结果

2.2 AXL跨膜区不同氨基酸突变后DNA序列比对结果

2.3 AXL 跨膜区单个氨基酸突变或缺失后 γ-分泌对底物 AXL 依然发挥剪切作用

2.4 AXL跨膜区靠近胞内的6个氨基酸和跨膜区外的4个氨基酸并非γ-分泌酶的剪切位点

2.5 γ-分泌酶对底物AXL的剪切位点位于跨膜区中靠近细胞膜外的前八个氨基酸

2.6γ-分泌酶对底物AXL有多个剪切位点

3讨论

全文总结

已完成的研究工作：

阶段性成果：

参考文献

综述:阿尔兹海默症关键酶γ-分泌酶的空间结构及调节剂的研究进展

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著