荧光蛋白的拉曼光谱研究及其结构与功能解析

摘要

荧光蛋白是现代生物学研究中的重要标记工具之一。科学家们基于已有发色团结构及荧光蛋白发光机理，已经获得了许多光学性质优良的荧光蛋白。就深层组织成像而言，所使用的荧光蛋白需要具有良好的单体性质，较高量子产率、较快的成熟时间，其荧光光谱应该更加靠近650 nm至1100nm的“近红外光学窗口”。然而，目前尚无同时满足这些要求的近红外荧光蛋白。　　为了能够更加理性的进化出性能优良的近红外荧光蛋白，我们仍需要聚焦荧光蛋白的发色团结构及其微环境。拉曼光谱是分子振动、转动状态的“指纹图谱”，生物大分子的拉曼光谱可以反应诸多分子结构信息。为此，本文深入研究了EGFP系列荧光蛋白(EGFP、ECFP、EYFP)和mNeptune及其突变体的拉曼光谱，创新性地将荧光蛋白的特征拉曼谱峰、发色团结构特征及其光学性质之间建立了关联，提出了影响荧光蛋白发射波长发生位移的可能性机制，具体如下:　　1.获得EGFP系列荧光蛋白的拉曼光谱，观察到C=N1谱峰变化，这是因为EGFP和ECFP的N1与H2O形成氢键，并且N1通过该氢键从H2O吸电子，相比于不存在该氢键作用的EYFP，这种吸电子效应造成C=N1谱峰红移。而EGFP中该氢键作用比ECFP更强，其具有更强的吸电子效应，因此，EGFP的C=N1谱峰相比于ECFP更加红移。　　2.EGFP系列荧光蛋白的拉曼光谱中，发现C5=C6谱峰位置与其最大吸收波长之间存在良好的直线关系，表明C5=C6的拉曼位移与荧光蛋白激发能之间存在激发能越小，C5=C6拉曼谱峰红移的现象。同样的，在mNeptune系列红色荧光蛋白中也发现类似现象，该现象产生的原因还需要进一步进行科学合理地解释。　　3.获得mNeptune系列红色荧光蛋白的拉曼光谱，发现mNeptune684的66Tyr苯酚环相关的拉曼谱峰变化的现象，相比于mNeptune，1170、1400蓝移到1176、1416 cm-1，1156 cm-1由于蓝移被1176 cm-1覆盖。这是因为在mNeptune684中，158N和143N形成协同的氢键作用，通过该作用对C12-O14及66Tyr的苯环产生吸电子效应，降低了66Tyr苯酚环的电子密度，造成其相关的拉曼谱峰同时发生蓝移。这是158N和143N协同的氢键作用对mNeptune系列荧光蛋白拉曼光谱产生改变的最直接的证据之一。基于此，预计在未来的近红外荧光蛋白往光谱更加红移的方向进化时，采用类似的方法产生更多协同的氢键作用，进一步拓展发色团的共轭平面。　　本研究不仅为荧光蛋白发色机理、波长红移等光学性质的阐释提供了重要理论依据，同时为荧光蛋白的体外进化提供了指导性的结构信息。此外，本研究进一步拓展了拉曼光谱在生物大分子结构研究中的应用。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

第一章 前言

1．1 拉曼光谱的简介

1．1．1 拉曼光谱的概述

1．1．2 拉曼光谱在生物大分子结构测定中的应用

1．1．3 拉曼光谱在荧光蛋白中的应用

1．2 荧光蛋白的简介

1．3 研究目标和内容

第二章 红色荧光蛋白mNeptune及其突变体的结晶

2．1 材料和方法

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 试剂与材料

2．1．3 培养基

2．1．4 主要溶液和配方

2．1．5 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 荧光蛋白的表达与纯化

2．2．2 SDS-PAGE检测荧光蛋白纯度

2．2．3 蛋白质浓度的测定

2．2．4 荧光蛋白mNeptune684、mNeptune674(G41Q_C158M)mNeptune669(G41Q)、mNeptune652(S28H)的结晶筛选

2．3 结果与分析

2．3．1 红色荧光蛋白mNeptune684、mNeptune674(G41Q_C158M)、mNeptune669(G41Q)、mNeptune652(S28H)的纯化

2．3．2 红色荧光蛋白mNeptune684、mNeptune674(G41Q_C158M)、mNeptune669(G41Q)、mNeptune652(S28H)结晶筛选

2．3．2 mNeptune684蛋白结构解析

2．4 结论

第三章 荧光蛋白的拉曼光谱研究

3．1 材料

3．1．1 菌株

3．1．2 试剂与材料

3．1．3 培养基

3．1．4 主要溶液及配方

3．1．5 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 荧光蛋白的表达与纯化

3．2．2 蛋白质浓度的测定

3．2．3 SDS-PAGE检测荧光蛋白纯度

3．2．4 拉曼光谱数据采集

3．2．5 拉曼光谱预处理与分析

3．3 结果与分析

3．3．1 荧光蛋白的纯化、SDS-PAGE及浓度测定

3．3．2 增强型荧光蛋白的拉曼光谱研究

3．3．3 mNeptune近红外荧光蛋白及其突变体的拉曼光谱研究

3．3 讨论

3．4 结论

参考文献

致谢