一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌研究生防菌在植株上的定殖的方法

摘要

本发明公开了一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌研究生防菌在植株上的定殖的方法，涉及基因工程技术领域，将所述表达黄绿荧光蛋白的生防菌按照待研究的生防菌施用方法对植物进行施用，检测施用部位生防菌的种群分布情况，定植的生防菌的种群数量越多、越稳定，该施用方法的定植效果越好，根据实际需求选择生防菌的使用方法。该方法不需特殊仪器，而且重复性较好。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌及其构建方 法与应用。

背景技术

大量研究表明，生防菌在植物根围和叶围能否有效定殖是生防菌能否起到稳定持久防 病效果的一个重要因素。其定殖能力受菌株自身的特性和周围环境中诸多因素的影响。由 于植物体内存在内生细菌，植物表面和土壤中存在多种细菌，而这些细菌的菌落形态很难 区别，由于受这些细菌的干扰，很难确定野生型的生防菌在植株根围和叶围的定殖情况。 目前研究生防菌在植株根围和叶围的定殖，应用最多的方法是用利福平诱导抗性菌株，该 方法需要逐步提高利福平的诱导浓度，耗时较长，并且获得性抗性菌株稳定性较差。用基 因标记菌株进行生防菌定殖研究报道较少，田涛等人借助于荧光显微镜，定性研究了绿色 荧光蛋白标记的生防芽孢杆菌在小麦根部能够定殖，该方法需特殊的仪器和较高的技术。

生防菌在实际应用中会受到很多因素的影响，生防菌被引入土壤和叶面之后后，往往 会受到原著菌群的抑菌作用以及生防菌与植物根部和叶部亲和能力的影响，这是导致生防 菌在实际应用中防效不稳定的重要原因之一。因此，生防菌能否在靶植物根际和叶围定殖 是生防菌能否发挥稳定作用的重要原因之一，也是筛选、评定生防菌的一个重要指标，并 最终决定该生防菌是否具有产业化前景。研究生防菌的定殖及其对原著微生物的影响具有 重要的理论意义和现实意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明采用SP盐方法将荧光蛋白基因导入野生型生防菌株中，通 过菌体发荧光特性、质粒DNA双酶切和SDS-PAGE鉴定，获得1株具有较强荧光表型的基因标记菌株，并且提供了利用上述基因标记菌株研究研究生防菌在植株上的定殖的方法。

首先，本发明提供一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌，所述生防菌为重组菌，宿主菌为 野生型生防菌株BS-17，宿主菌中转化有含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体。

所述野生型生防菌株BS-17在《生物技术》2011年第03期中公开，文章标题为《生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究》，作者于德水、高娃、沙长青、张淑梅、 高继国。

所述pHPS9质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，结构如图1所示，含有CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基 因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述EYFP基因 为增强型黄绿荧光蛋白基因。

所述含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体，其结构为，在pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点连接有EYFP基因。

所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。

所述双酶切位点为BamHI酶切与EcoRI酶的双酶切位点。

第二，本发明提供上述表达黄绿荧光蛋白的生防菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将EYFP基因连接到pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点，得 到含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体；

(2)将步骤(1)所得的表达载体转化到野生型生防菌株BS-17中，即得到表达黄绿荧光蛋白的生防菌。

步骤(1)所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。

所述pHPS9质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，结构如图1所示，含有CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基 因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述EYFP基因 为增强型黄绿荧光蛋白基因。

步骤(1)所述双酶切位点为BamHI酶切与EcoRI酶的双酶切位点。

步骤(2)所述野生型生防菌株BS-17在《生物技术》2011年第03期中公开，文章 标题为《生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究》，作者于德水、高娃、沙长青、 张淑梅、高继国。

第三，本发明还提供利用上述表达黄绿荧光蛋白的生防菌研究生防菌在植株上的定殖 的方法，具体为：将所述表达黄绿荧光蛋白的生防菌按照待研究的生防菌施用方法对植物 进行施用，检测施用部位生防菌的种群分布情况，定植的生防菌的种群数量越多、越稳定， 该施用方法的定植效果越好，根据实际需求选择生防菌的使用方法。

所述施用方法为浸种法、浇穴法或喷施方法。

所述检测施用部位生防菌的种群分布情况，方法为：取待测植株用水洗净后，取待测 施用部位，浸泡乙醇溶液，捞出沥干后放到灭菌的研钵中，加无菌水研磨，取研磨所得液体，涂布于加氯霉素的LB平板培养基上，每个待测施用部位样品涂3个平板，重复3次， 30℃温箱中培养24～48h，计算每皿的菌落数，每种使用方法测定10株样本，取平均值 算出每个植株不同部位的细菌种群数量。

当施用方法为浸种法或浇穴时，所述待测施用部位为根部、茎基部或茎中部；当施用 方法为喷施方法时，所述待测施用部位为叶片。

所述乙醇溶液为70％wt的乙醇水溶液，浸泡乙醇溶液的时间为5min。

所述LB平板培养基中包括：NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯霉素在其中的浓度我10μg/mL。

所述表达黄绿荧光蛋白的生防菌的构建方法为：

(1)将EYFP基因连接到pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点，得 到含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体；

(2)将步骤(1)所得的表达载体转化到野生型生防菌株BS-17中，即得到表达黄绿荧光蛋白的生防菌。

步骤(1)所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。

所述pHPS9质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，结构如图1所示，含有CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基 因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述EYFP基因 为增强型黄绿荧光蛋白基因。

步骤(1)所述双酶切位点为BamHI酶切与EcoRI酶的双酶切位点。

步骤(2)所述野生型生防菌株BS-17在《生物技术》2011年第03期中公开，文章 标题为《生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究》，作者于德水、高娃、沙长青、 张淑梅、高继国。

有益效果

本发明利用质粒载体上的氯霉素抗性基因作为筛选标记，排除土著杂菌的干扰，采用 常规的细菌计数方法定量的研究了生防菌在番茄根围和叶围的定殖规律。该方法不需特殊 仪器，而且重复性较好。浸种处理结果，生防菌在茎基部的定殖密度大于根部。浇穴处理 表明生防菌在根部的定殖密度大于茎基部。这一结果可以为应用BS-17野生型菌株进行的 棚室番茄枯萎病、灰霉病和叶霉病防效试验提供了理论依据，用生防菌液浸种、浇穴及喷 洒处理对番茄枯萎病、灰霉病和叶霉病的防效高于单一浸种、单一浇穴和单一喷洒处理。 本发明的研究表明，3种处理方法相结合对于生防菌在番茄根围和叶围的定殖具有增效作 用，可以增加生防菌在根围合叶围的种群数量，有效抵御病原菌的侵入和定殖，从而起到 很好的防病效果。

附图说明

图1表达载体的构建图；

图2质粒pEYFP DNA EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切电泳图，图中，1：质粒pEYFP DNA； 2：质粒pEYFP DNAEcoRⅠ/BamHⅠ双酶切；M：λDNA/HindⅢMarker(23130、9461、 6556、4361、2322、2027、564)；

图3质粒pHPS9-EYFP DNA电泳图，图中，1-5：质粒pHPS9-EYFP DNA； M：λDNA/HindⅢMarker；

图4阳性重组子双酶切结果，图中，M：λDNA/HindⅢMarker；1：质粒pEYFP EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切；2：质粒pHPS9-EYFP EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切；

图5Bacillus subtilis BS-17生长曲线；

图6转化子图片，图中，1、3、4为转化子平板；2为对照平板(BS-17菌液涂板)；

图7重组子荧光显微镜照片(放大倍数：800×)；

图8重组子质粒DNA，图中，1.λDNAHindⅢ酶切marker；2.3.4.强荧光重组子质 粒DNA；5.弱荧光重组子质粒DNA；

图9重组子双酶切结果，图中，1.重组子EcoRI和BamHI双酶切；2.λDNAHindⅢ酶 切marker；

图10重组子SDS-PAGE电泳，图中，1.野生型生防菌BS-17；2.3.基因标记生防菌；4.蛋白质低分子量标准(97、66、43、31、20、14KD)；

图11生防工程菌株稳定性测定结果，图中，A：Botrytis cinerea；B：Fusariumoxysporum；C：Cladosporium fulvum；

图12工程菌的抑菌效果；

图13浸种处理生防工程菌在番茄各个部位的种群分布；

图14浇穴处理生防工程菌在番茄各部位的种群分布；

图15喷洒处理生防工程菌在番茄叶部的种群分布。

具体实施方式

培养基与培养条件

大肠杆菌用LB培养基，37℃培养。LB：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母抽提物5g，1000mL水，pH7.0，121℃灭菌20min。

试剂

限制性内切酶，T

抗生素与溶液

氨苄青霉素(Amp)，工作浓度50μg/mL；氯霉素(Cm)，工作浓度10μg/mL。

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ⅱ:0.2mmol/LNaOH，1％SDS

溶液Ⅲ：5mmol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，双蒸水28.5mL

TE：10mmol/LTris.HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)

RNase溶液：10mgRNase溶于1mL 10mmol/LTris.HCl(pH7.5)，15mmol/LNaCl中，于100℃ 加热15min，冷却后保存于-20℃。

仪器

台式高速离心机LG15-W(北京医用离心机厂)，电热恒温水浴锅HWS24(上海一恒科技有限公司)，电热恒温培养箱WMK-02(南京电器厂)，紫外分光光度计LINDA(日本 岛津公司)，电子分析天平AEL-160(日本岛津公司)，凝胶成像系统UVP(英国Cambridge 紫外仪器有限公司)。

实施例1表达黄绿荧光蛋白的生防菌的构建方法

一、构建黄绿荧光蛋白基因(EYFP)的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体

1、质粒提取

采用碱裂解法从大肠杆菌E.coli.DH5α中提取pEYFP和pHPS9质粒DNA。

所使用的大肠杆菌E.coli.DH5 α基因型为supE44 △lacU169(Φ80lacZ △M15)hsdR17 recA1 end A1 gyr96，上述大肠杆菌中分别转化pEYFP基因片段和pHPS9质粒DNA，所述pHPS9 质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，结构如图1所示，含有CmR基因、 ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述pEYFP基因片段携带有增 强型黄绿荧光蛋白基因EYFP与氨苄青霉素抗性基因AmpR。活化含pEYFP和pHPS9质粒 DNA的大肠杆菌，用-70℃保存的菌液划线接种于LB加相应抗生素固体平板上，37℃过夜 培养，取单菌落转接于5mLLB+Cm(pHPS9)和5mLLB+Amp(pEYFP)液体培养基中，37℃过夜 培养，按1％接种量再分别转接于50mLLB加相应抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。 次日取50mL菌液，在4℃，4000r/min转数下，离心10min，弃去上清液，用2mL含10mg Lysozyme的溶液Ⅰ溶解菌体，室温放置5min，加入4mL溶液Ⅱ，温和倒置数次使其混合 均匀，置于冰上10min，再加入3ml溶液Ⅲ，快速倒置数次于冰上10min，以13000r/min 转数离心30min，向上清液中加入0.6倍体积异丙醇，室温放置15min，在12000r/min转 速数下离心30min，加入0.5mlTE溶解沉淀，再加入RNA酶10μl，放入37℃水浴中反应1h，加入等体积酚、酚-氯仿、氯仿抽提，用100％乙醇沉淀质粒DNA，用70％冰冷的乙 醇洗1次，沉淀干燥后，溶于50μlTE中，置于-20℃冰柜中备用。

2、双酶切反应

先用BamHI酶切pEYFP和pHPS9质粒DNA，10μl反应体积中含1-2μgpEYFP或pHPS9 质粒DNA，1μl 10×B buffer，1-2U BamHI，加入ddH

3、连接反应

10μl反应体积中含有1μl 10倍连接缓冲液，2U T

4、感受态细胞制作与转化

从平板上挑取E.coli.DH5 α单菌落接种于5mLLB培养液中，37℃过夜培养，次日按1％ 接种量转接于50mLLB培养液中，在37℃水浴摇床中快速震荡培养至OD

取100μl冷冻的感受态细胞放入冰浴中融化，加入20μl50mmol/LCaCl

5、阳性重组子筛选与鉴定

随机挑选单菌落，用煮沸法快提质粒DNA，先用1％琼脂糖凝胶电泳初筛DNA分子量大于质粒载体(pHPS9)的重组子DNA，再用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切方法进一步验证重组 子。

结果与讨论

质粒DNA浓度与纯度

用LB培养液过夜培养，取50mL菌液离心收集菌体，按方法所述提取质粒DNA，用 紫外吸收法测定DNA纯度，琼脂糖电泳法测定DNA分子量大小。50mL菌液可以获得30 μg pEYFPDNA和26μg pHPS9 DNA，经测定，其OD

表达载体的构建

按照图1构建表达载体。将EYFP基因连接到穿梭质粒表达载体pHPS9多克隆位点区。

阳性重组子筛选与鉴定

10μl连接液转化100μl感受态细胞，涂2个LB+Cm平板，37℃培养18h，每个平板上均有200多个转化子，随机挑取10个转化子，提取质粒DNA，并用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶 切下与EYFP基因大小一致的DNA片段，证明该转化子为阳性重组子。结果见图2、3、4。

结论

利用DNA重组技术，成功地将黄绿荧光蛋白基因(EYFP)重组到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体pHPS9上，获得了含EYFP基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体pHPS9-EYFP，从而为生防菌株的基因标记提供了必要的材料。

二、构建表达黄绿荧光蛋白的生防菌基因工程菌

利用SP盐方法将带有黄绿荧光蛋白基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载 体pHPS9-EYFP导入野生型内生枯草芽孢杆菌BS-17菌株中，利用黄绿荧光蛋白在荧光显微镜下发光特性、质粒DNA双酶切和SDS-PAGE鉴定是否获得生防工程菌株。

Bacillus subtilis BS-17(即野生型生防菌株BS-17)生长曲线的测定

Bacillus subtilisBS-17单菌落接种至5mLLB培养基中，30℃250r/min培养过夜。次日按 2％接种量接种于50mL SPI培养基中，30℃250r/min培养10h，每隔1h，取样测定OD

Bacillus subtilisBS-17感受态细胞的制备与转化

Bacillus subtilisBS-17单菌落接种至5mLLB培养基中，30℃250r/min培养过夜。次日取 100μL菌液接种至5mL SPI培养基中，30℃250r/min培养至对数后期。取200μL菌液接 种至2mL SPⅡ培养基中，30℃100r/min培养1.5h。加入20μL CAYE(100×)于30℃放置10min，分装成每管500μL。加入1μg pHPS9-EYFP穿梭质粒，轻轻均匀后先于30℃ 100r/min培养30min，再于30℃250r/min培养1.5h，取菌液涂布在含Cm的LB平板，培 养18～24h。

阳性重组子的检测

荧光检测：从平板上挑取单菌落涂在载波片上，在荧光显微镜下观察菌体是否发光。

重组质粒双酶切检测：按如下方法提取重组子质粒DNA：取发荧光的菌落，先接种于5mL含Cm抗性LB培养液中，30℃200r/min培养过夜。次日转接于250mL预热的含 Cm抗性LB培养液中，30℃200r/min培养2～3h，至OD

荧光蛋白的检测

取1.5mL培养24h的菌液，离心收集菌体，加入裂解液，100℃水浴煮沸3min，离心取上清进行SDS-PAGE电泳。

结果与讨论

Bacillus subtilis BS-17生长曲线的测定结果

按方法所述测定Bacillus subtilis BS-17菌的生长曲线，该菌在接种1h后进入对数生长 期，4h后进入对数生长后期，5h后进入稳定期，测定该菌的生长曲线可以为感受态细胞 制备提供理论依据。结果见图5。

转化率测定结果

采用SP盐方法将1μg pHPS9-EYFP穿梭质粒导入野生型生防菌株Bacillussubtilis BS-17 中，转化率为1.68×10

阳性重组子的鉴定

随机挑取转化子菌落点在载玻片上，置于荧光显微镜下观察，发出黄绿荧光的为阳性 重组子(见图8)。共随机挑取10个转化子镜检，均能发出黄绿荧光，但是荧光强弱不同。 按方法所述提取10个转化子的质粒DNA，从荧光较强的菌株中提取的质粒DNA量大，较弱的菌株中提取的质粒DNA量小。结果见图8。用EcoRI和BamHI双酶切强荧光菌株的质 粒DNA能够在约714bp获得一条DNA片段。结果见图9。SDS-PAGE电泳检测，强荧光菌 体的裂解液在27KD处有一条明亮的蛋白条带，蛋白的大小与绿色荧光蛋白大小相当。结 果见图10。通过3种方法检测，证明已获得含荧光基因标记的Bacillus subtilis BS-17菌株， 即表达黄绿荧光蛋白的生防菌基因工程菌。

结论

采用SP盐方法成功地将荧光蛋白基因导入野生型生防菌株BS-17中，通过菌体发荧 光特性、质粒DNA双酶切和SDS-PAGE鉴定，获得1株具有较强荧光表型的表达黄绿荧光蛋白的生防菌基因工程菌，为利用基因标记菌株研究生防菌在植株上的定殖提供了必备的菌株。

对制备的表达黄绿荧光蛋白的生防菌基因工程菌进行稳定性与抑菌活性研究

为了确定外源质粒在生防工程菌中是否能稳定遗传，本研究采用无抗性培养液连续稀 释培养方法，连续培养50h，质粒遗传稳定性为94％。采用菌丝生长速率方法测定生防工程菌对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、叶霉病菌Cladosporium fulvum和枯萎病菌Fusarium oxysporum的平皿抑菌率分别为85.5％、86.5％和89.8％，同野生型生防菌株BS-17 对番茄3种病原菌的抑菌率相比，无显著差异。

培养基与试剂

NYD液体和固体培养基，PDA培养基，所用试剂均为分析纯。

抗生素

氯霉素购自TaKaRa公司，使用浓度10μg/mL。

野生型生防菌BS-17与表达黄绿荧光蛋白的生防菌基因工程菌的培养

培养两种菌的程序和所用的培养基相同，只是在培养工程菌的培养基中加氯霉素(10 μg/mL)。培养程序如下：用-70℃保存的菌液划线接种于NYDA平板上，30℃温箱过夜培养，次日挑取单菌落转接于5mL NYD液体培养基中，30℃200rpm/min振荡培养18h，按 2％接种量转接于50mL NYD培养液中，30℃200rpm/min振荡培养48h，采用平板稀释法 测定菌数。

生防工程菌株稳定性测定

过夜活化菌液，以1％接种量接种于无抗性的NYD培养液中，于30℃200rpm/min振荡培养5h，再以1％接种量接种于无抗生素的NYD培养液中于同样条件下培养，如此重 复培养至50h，然后涂布于无抗生素的NYD平板上，随机选取200个克隆转接于抗性平 板，以抗性菌株所占百分比计算工程菌株的遗传稳定性。

工程菌株抑菌活性检测

用PDA平板分别培养Fusarium oxysporum、Botrytis cinerea和Cladosporiumfulvum病 原菌，28℃培养7d，作接种原。将野生型BS-17菌液稀释成与工程菌液同浓度，分别取 100μL，先涂布于PDA平板上，再分别接种Fusarium oxysporum，Botrytis cinerea和Cladosporium fulvump(直径6mm)菌丝块，以涂布无菌水作对照，28℃培养直至对照菌 丝长满平板，测量菌丝直径，每个处理重复3次，计算抑菌率。

菌液浓度测定

按照方法所述，用平板稀释法测定培养48h的菌液浓度，结果见表1。

表1野生型菌和工程菌液浓度测定

在相同条件下培养，野生型菌株生长速度远远大于工程菌株的生长速度，原因是工程 菌株中含有外源基因，影响原有菌株的生长。要想将工程菌作为生产菌株，还需对其发酵 工艺进行系统研究，提高菌液效价，使其与野生型菌的效价相当。

生防工程菌株稳定性测定结果

将工程菌株连续稀释培养，每隔5h取样涂板，实验结果表明，在该条件下其遗传稳定性为94％。结果见图11。

芽孢杆菌在实验室条件下大约20min分裂一代，而其在自然条件下分裂一代所需时 间为50～100h，是实验条件下150～300倍。因此，我们可以认为即使进行一个生长季节的 追踪检测，工程菌株的遗传稳定性也基本满足研究需要。

工程菌株抑菌活性检测结果

将野生型菌液稀释100倍，使其与工程菌原液浓度相当，分别取100μL作抑菌试验，结果见表2和图12。

表2生防菌液对番茄灰霉病、叶霉病和枯萎病菌的抑菌作用

注：1:Botrytis cinerea 2:Cladosporium fulvum 3:Fusarium oxysporum

通过t检验，生防工程菌液对Fusarium oxysporum抑菌率的t

结论

生防工程菌中带有基因标记的质粒稳定性较好，在应用中丢失可能性较小。

生防工程菌对病原菌Fusarium oxysporum、Botrytis cinerea和Cladosporiumfulvum的 抑菌率与野生型菌株相当，无显著差异，该生防工程菌可以替代野生菌用于生防菌生防机 制的研究。

生防工程菌与野生型菌在相同条件下培养，菌体数量远远少于野生型菌株，今后还需 进一步研究生防工程菌的发酵工艺，提高菌体数量。

实施例2利用实施例1制备的表达黄绿荧光蛋白的生防菌研究生防菌在植株上的定 殖的方法

野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisBS-17能有效地防治由Botrytiscinerea、 Cladosporium fulvum和Fusarium oxysporum引起的番茄灰霉病、叶霉病和枯萎病。为了探 究该菌株的生防机制，利用该菌株的黄绿荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因标记菌株研究其 在番茄植株各个部位的定殖能力、种群动态和分布。研究表明，用基因标记菌株发酵液分 别对番茄进行浸种和浇穴处理，该菌能在番茄根部和茎基部定殖；喷洒处理，该菌能在叶 部定殖。播种30d后，生防菌种群数量在番茄根部、茎基部和叶部的种群数量均曾下降趋 势。

生防菌在实际应用中会受到很多因素的影响，生防菌被引入土壤和叶面之后后，往往 会受到原著菌群的抑菌作用以及生防菌与植物根部和叶部亲和能力的影响，这是导致生防 菌在实际应用中防效不稳定的重要原因之一。因此，生防菌能否在靶植物根际和叶围定殖 是生防菌能否发挥稳定作用的重要原因之一，也是筛选、评定生防菌的一个重要指标，并 最终决定该生防菌是否具有产业化前景。为了进一步确定生防菌BS-17对番茄灰霉病、叶 霉病和枯萎病的防效稳定性及持久性，为该菌剂的商品化及生物农药登记提供充分理论依 据，研究生防菌的定殖及其对原著微生物的影响具有重要的理论意义和现实意义。本文利 用基因标记菌株中质粒载体上的氯霉素抗性基因作为筛选标记，对该生防菌在番茄根围和 叶围的定殖进行了初步研究。

供试菌株和供试品种：

实施例1制备的基因工程菌是基因标记菌株，含有质粒pHPS9-YFP，质粒上带有黄绿 荧光蛋白和氯霉素抗性基因，菌体在荧光显微镜下发黄绿荧光，在氯霉素抗性培养基上生 长，该菌株的菌落形态特征，离体拮抗特性与野生型菌株一致，生长速度比野生型菌株慢， 该菌株为本研究室自行构建。

供试番茄品种为合作903，上海番茄研究所，购自种子公司。

试剂

氯霉素购自Promega公司，蛋白胨，酵母抽提物，氯化钠，琼脂粉均为进口分析纯，购自奥博星公司。

仪器

NSZ-H水浴摇床，OLYMPUS显微镜，MODEL24恒温培养箱培养箱，超净工作台。

抗生素与培养基

氯霉素工作浓度10μg/mL；培养菌用LB液体培养基，测定菌数用LB固体培养基。

方法

1、菌液(菌悬液)制备

取-70℃保存的液体菌液在LB固体加氯霉素的抗性平板上活化，取单菌落接种于5mlLB加氯霉素的液体培养基中，30℃过夜培养，再以2％接种量转接于100mLLB加氯霉 素的液体培养基中，30℃，150r/min震荡培养48h，用平板菌落计数法测定菌液活菌数。

盆栽定殖试验

浸种处理：设1个处理，1个对照。每个处理4个重复，每个重复5个花盆，每盆播 种4粒种子。

处理1：药剂浸种，挑选饱满的番茄种子，用无菌水过夜浸泡，催小芽后，置于5mL菌悬液中浸泡30min，捞出沥干，播种于花盆中，定时定量浇水，出苗后5、10、15、20、 2530d取番茄植株测定各部位的带菌量。

空白对照：无菌水浸种：用无菌水代替菌液浸种，其他步骤同上。

浇穴处理：设1个处理，1个对照。每个处理4个重复，每个重复5个花盆，每盆播 种4粒种子。

处理1：浇穴方式，先将200μl菌液浇入土穴中，再将催小芽后的番茄种子置于穴中， 管理方法与浸种方式相同，出苗后5、10、15、20、25、30d取番茄植株测定各部位的带 菌量。

空白对照：无菌水浇穴，用无菌水代替菌液浇穴，其他步骤同上。

喷洒处理：设1个处理，1个对照。每个处理4个重复，每个重复5个花盆，每盆播 种4粒种子

处理1：喷洒方式，在番茄3叶期，用原菌液20ml均匀喷洒到番茄叶片上，正常管理，在处理后1、5、10、15、20、25、30d分别取接菌的叶片，用直径6mm打孔器在每 片叶子上打取3个叶圆片测定菌数。

空白对照：无菌水喷洒，用无菌水代替菌液喷洒。

浸种处理种子的初始接种量测定

随机挑取浸种和对照处理的番茄种子各10粒，每粒种子分别放入10mL无菌水中，充分震荡后，倍比稀释成10

植株各部位定殖菌数的测定

浸种和浇穴处理：每次随机挑取各个处理的番茄完整植株2株，用水冲净泥土后，用无菌水冲洗3次，将根部、茎基部、茎中部和叶部剪下，分别浸泡70％乙醇5min中， 捞出沥干后放到灭菌的研钵中，加入2mL无菌水研磨，取0.1mL液体涂布于LB加氯霉素 的平板上，每个样品涂3个平板，重复3次，30℃温箱中培养24～48h，计算每皿的菌落 数，每个处理测定10株样本，取平均值算出每个植株不同部位的细菌种群数量。

喷洒处理：每次取2片叶片，用直径6mm打孔器在每片叶子上打取3个叶圆片测定菌数(浸泡乙醇以后的步骤同上)。

结果与分析

初始菌液密度测定

采用平板菌落计数法测定的菌液密度为6.3×10

每粒种子初始接种量测定

浸种处理，每粒种子初始带菌量为3.2×10

表3每粒种子初始接种量

生防工程菌在番茄各部位的种群分布

研究表明，浸种处理生防工程菌能在番茄根部和茎基部很好定殖，不能在茎中部和叶 部定殖。播种30d后，该菌在番茄根部和茎基部的种群数量均呈下降趋势。根部的种群数 量曾现先增加后减少直至稳定的动态规律，出苗后10d菌数达最大值，然后降低，20d降至最低，然后稳定。茎基部种群数量曾现先增加后稳定的动态规律。出苗后20d菌数最多，然后稳定。在30d，定殖在根部的菌数低于茎基部(表4)。

浇穴处理生防工程菌能在番茄根部和茎基部很好定殖，播种30d后，该菌在番茄根部 和茎基部的种群数量均呈下降趋势。根部和茎基部的生防菌种群数量先增加后减少，根部 的生防菌种群数量在出苗后15d达到最大值，茎基部的种群数量在出苗后20d达到最大值。 在30d，定殖在根部的菌数高于茎基部(表5)。

喷洒处理生防工程菌能在番茄叶部很好定殖。喷洒处理后至第15d，菌数稳定不变， 在第20d，菌数下降，之后菌数稳定直至第30d(表6)。

浸种处理，随着种子的萌发，该菌可以随着根的生长从茎基部向根部传送；浇穴处理， 随着种子的生长，可以从根部吸收根围土壤中的该菌，并向上传输到茎基部，两种处理方 式相结合，能够增加根部和茎基部中的生防菌数量。喷洒处理，该菌能在叶部长期定殖。由此可见，该菌在番茄根部、茎基部和叶部具有很强的定殖能力，因此，实际应用时采用3种方式相结合可以起到更好的防治效果。

表4浸种处理生防工程菌在番茄各部位的种群分布

表5喷洒处理生防工程菌在番茄叶部的种群数量

表6浇穴处理生防工程菌在番茄各部位的种群分布

讨论

大量研究表明，生防菌在植物根围和叶围能否有效定殖是生防菌能否起到稳定持久防 病效果的一个重要因素。其定殖能力受菌株自身的特性和周围环境中诸多因素的影响。由 于植物体内存在内生细菌，植物表面和土壤中存在多种细菌，而这些细菌的菌落形态很难 区别，由于受这些细菌的干扰，很难确定野生型的生防菌在植株根围和叶围的定殖情况。 目前研究生防菌在植株根围和叶围的定殖，应用最多的方法是用利福平诱导抗性菌株，该 方法需要逐步提高利福平的诱导浓度，耗时较长，并且获得性抗性菌株稳定性较差。用基 因标记菌株进行生防菌定殖研究报道较少，田涛等人借助于荧光显微镜，定性研究了绿色 荧光蛋白标记的生防芽孢杆菌在小麦根部能够定殖，该方法需特殊的仪器和较高的技术。 我们利用质粒载体上的氯霉素抗性基因作为筛选标记，排除土著杂菌的干扰，采用常规的 细菌计数方法定量的研究了生防菌在番茄根围和叶围的定殖规律。该方法不需特殊仪器， 而且重复性较好。浸种处理结果与田涛等人的研究结果相似，生防菌在茎基部的定殖密度 大于根部。浇穴处理表明生防菌在根部的定殖密度大于茎基部。这一结果为应用BS-17野 生型菌株进行的棚室番茄枯萎病、灰霉病和叶霉病防效试验提供了理论依据，用生防菌液 浸种、浇穴及喷洒处理对番茄枯萎病、灰霉病和叶霉病的防效高于单一浸种、单一浇穴和 单一喷洒处理。本项研究表明，3种处理方法相结合对于生防菌在番茄根围和叶围的定殖 具有增效作用，可以增加生防菌在根围合叶围的种群数量，有效抵御病原菌的侵入和定殖， 从而起到很好的防病效果。