声明
1 绪论
1.1 脂肪酶概述
1.1.1 脂肪酶简介
1.1.2 脂肪酶的应用
1.2 米根霉脂肪酶的研究进展
1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统
1.3.1 毕赤酵母表达系统概述
1.3.2 常见毕赤酵母表达宿主
1.3.3 毕赤酵母表达载体
1.3.4 毕赤酵母分子遗传操作
1.3.5 影响外源基因在毕赤酵母中表达水平的主要因素
1.3.6 毕赤酵母高密度发酵
1.3.7 米根霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达
1.4 研究背景及意义
2 影响米根霉脂肪酶在毕赤酵母中高效表达的关键因子探索
2.1 材料和方法
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 试剂和仪器
2.1.3 培养基和溶液
2.1.4 实验操作方法
2.1.5 米根霉脂肪酶基因的克隆
2.1.6 重组载体的构建
2.1.7 毕赤酵母重组菌的构建与验证
2.1.8 摇瓶发酵
2.1.9 脂肪酶活力的测定
2.1.10 摇瓶发酵条件的单因素优化
2.1.11 3-L高密度发酵
2.1.12 生物量和细胞OD600nm的测定
2.1.13 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
2.1.14 统计学分析
2.2 结果与分析
2.2.1 米根霉脂肪酶基因的克隆
2.2.2 重组载体的构建
2.2.3 前序列对ROL表达的影响
2.2.4 载体整合位点对proROL表达的影响
2.2.5 对比使用不同启动子时proROL重组蛋白的表达水平
2.2.6 基因拷贝数对proROL表达量的影响
2.2.7 摇瓶发酵条件对proROL表达量的影响
2.2.8 重组菌的高密度发酵
2.3 讨论与小结
2.3.1 讨论
2.3.2 小结
3 探索PTVA法实现毕赤酵母基因拷贝数增加的机制
3.1 材料与方法
3.1.1 菌株和质粒
3.1.2 试剂和仪器
3.1.3 缓冲液与培养基
3.1.4 重组载体的构建
3.1.5 PTVA实验菌株的构建
3.1.6 重组菌实施PTVA筛选
3.1.7 摇瓶发酵
3.1.8 脂肪酶活力的测定
3.1.9 重组菌中ROL基因拷贝数的测定
3.2 结果与分析
3.2.1 重组载体的构建
3.2.2 PTVA实验菌株的构建
3.2.3 PTVA机制的探究
3.3 讨论与小结
3.3.1 讨论
3.3.2 小结
4 优化基因拷贝数提高ROL在毕赤酵母中的表达水平
4.1 材料与方法
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 试剂和仪器
4.1.3 缓冲液与培养基
4.1.4 重组载体的构建
4.1.5 含不同ROL基因拷贝数重组菌株的构建
4.1.6 毕赤酵母重组菌中ROL基因拷贝数的测定
4.1.7 重组菌的摇瓶发酵
4.1.8 单因素优化摇瓶发酵条件
4.1.9 3-L发酵罐高密度发酵
4.1.10 生物量和细胞OD600nm的测定
4.1.11 脂肪酶活力测定
4.1.12 表达产物的检测与蛋白浓度的测定
4.1.13 重组菌遗传稳定性检测
4.2 结果与分析
4.2.1 单拷贝表达载体pAOα-ROL的构建
4.2.2 改进的“生物砖”法能极大地提高构建ROL基因多拷贝表达载体的效率
4.2.3 含不同拷贝ROL基因重组菌的构建与筛选
4.2.4 基因剂量对重组菌生产ROL脂肪酶的影响
4.2.5重组菌GS115/pAOα-5ROL 11#遗传稳定性检测
4.2.6 重组菌的摇瓶发酵条件优化
4.2.73-L高密度发酵对重组菌GS115/pAOα-5ROL 11#生产ROL的影响
4.2.8 高密度发酵所产重组蛋白的SDS-PAGE和质谱检测
4.3 讨论与小结
4.3.1 讨论
4.3.2 小结
5 共表达辅助蛋白进一步增强ROL在重组菌中的表达
5.1 材料与方法
5.1.1 菌株和质粒
5.1.2 试剂和仪器
5.1.3 缓冲液与培养基
5.1.4 表达载体的构建
5.1.5 辅助蛋白与ROL共表达重组菌的构建与定性筛选
5.1.6 重组菌的摇瓶发酵
5.1.7 3-L高密度发酵
5.1.8 脂肪酶活力测定
5.1.9 生物量和细胞OD600nm的测定
5.1.10 表达产物的检测与蛋白浓度的测定
5.1.11 毕赤酵母重组菌中外源基因拷贝数的测定
5.2 结果与分析
5.2.1 不同拷贝Pdi基因的共表达对ROL表达水平的影响
5.2.2 不同辅助蛋白对重组ROL表达量的影响
5.2.3 共表达多个辅助蛋白对ROL表达的影响
5.2.4 优良工程菌在高密度环境下的产酶能力对比
5.3 讨论与小结
5.3.1 讨论
5.3.2 小结
6 面向食品医药的新型毕赤酵母基因操作方法探索与开发
6.1 材料与方法
6.1.1 菌株和质粒
6.1.2 试剂和仪器
6.1.3 缓冲液与培养基
6.1.4 重组载体的构建
6.1.5 基因缺陷型菌株的构建与筛选
6.1.6 无抗性标记残留表达载体在毕赤酵母中的转化与筛选
6.1.7 重组菌的摇瓶发酵和ROL酶活力的检测
6.2 结果与分析
6.2.1 使用双交换法敲除毕赤酵母基因
6.2.2 使用改进的Pop-in/Pop-out法敲除毕赤酵母基因
6.2.3 敲除Gas1基因提高ROL重组蛋白的表达量
6.2.4 基于改进的Pop-in/Pop-out法实现基因在毕赤酵母中的无抗性整合
6.2.5 X-71型宿主中转化66-71型载体实现目的基因的无抗性整合
6.2.6 使用66-R66型和R71-71型载体实现基因的连续无抗性整合
6.3 讨论与小结
6.3.1 讨论
6.3.2 小结
7 全文总结与展望
7.1 全文总结
7.2 展望
主要创新点
致谢
参考文献
附录1 攻读博士研究生期间发表的学术成果
附录2 基因序列
附录3 各种仪器与设备
华中科技大学;
