绵羊肺炎支原体LY-1株分离鉴定及HSP70P30基因克隆和序列分析

摘要

羊传染性胸膜肺炎是由支原体引起的羊的一种高度接触性传染病，绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）是其重要病原之一。本研究从发病羊的肺脏病料中成功分离出1株绵羊肺炎支原体，并对其生物学特性和免疫原性基因等进行了系统研究，得到了以下研究结果：　　1.2016年11月，河南省卢氏县某规模化湖羊场发生疑似绵羊传染性胸膜肺炎的病例。羔羊和成年羊均可发生，但羔羊症状表现较重。羔羊死亡率约30％，成年羊未见死亡。病羊体温升高、精神沉郁、食欲减退、咳嗽、呼吸困难和突然死亡。剖检发现其以胸、胸膜和肺脏的浆液性和纤维素性炎症为主要病变特征，具体表现为胸腔和心包有淡黄色积液，胸膜变厚而粗糙，上有黄白色纤维素性沉积，部分羊只发生胸膜与肋膜、心包发生粘连；肺表面有出血点，肺小叶间组织变宽，肺脏色泽变暗等典型病变。通过临床症状和病理剖检，初步判定该病为绵羊传染性胸膜肺炎。　　2.从发病羊的肺脏病料中分离鉴定出1株疑似支原体，命名为 LY-1株。该菌培养困难，但在 PPLO固体培养基中，经37℃静置培养5~7日，可长成圆形、透明、露滴状的针尖大小的菌落；培养14~16日，可长成圆形、中心发暗、周围透明、直径2~3 mm的“煎荷包蛋”状菌落。革兰氏染色镜检结果表明，该菌呈球状、两极状、杆状等的多形性。生化试验结果表明，该菌能发酵葡萄糖，但不能利用精氨酸与尿素。上述培养特性、菌体形态和生化特性均符合支原体的特征。药敏试验结果表明，该菌对阿奇霉素、氧氟沙星、环丙沙星高度敏感；对四环素中度敏感，对红霉素、庆大霉素和卡那霉素具有耐药性。　　3.提取该菌的基因组为模板，使用支原体 PCR检测试剂盒鉴定，确定该菌为支原体；进一步使用特异性引物 PCR鉴定该菌为绵羊肺炎支原体（361 bp）。PCR扩增其16S rRNA全基因（1469 bp）并进行测序和 BLAST比对分析，与其同源性最高的均为 NCBI数据库已发布的绵羊肺炎支原体的16S rRNA基因序列，其同源性均在99%以上。进一步构建16S rRNA基因的系统发育树，表明LY-1株与绵羊肺炎支原体FJ-FZ株和FJ-SM株亲缘关系最近。以上鉴定结果均表明LY-1分离株为绵羊肺炎支原体。　　4.热休克蛋白 HSP70和黏附因子蛋白 P30是支原体重要的保护性抗原因子。以LY-1株基因组为模板，分别扩增了其大小为738 bp的HSP70基因和786 bp的P30基因，BLAST比对结果表明，HSP70基因与NCBI已报到猪肺炎支原体序列 CP003131.1的同源为77%。P30基因与 NCBI已报到猪肺炎支原体序列CP003131.1的同源性为80%。其基因和蛋白特性值得进一步研究。

目录

声明

符号表

第1章 文献综述

1.1 绵羊肺炎支原体的形态结构与培养特性

1.2 绵羊肺炎支原体的流行病学

1.3 绵羊肺炎支原体的免疫学

1.4 羊支原体疫苗研究进展

1.5 展望

1.6 本研究的目的与意义

第2章 绵羊肺炎支原体的分离与鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 病料来源

2.1.2 实验所用试剂及配置方法

2.1.3 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 支原体的分离培养

2.2.2 支原体形态观察

2.2.3 生化试验

2.2.4 药敏试验

2.2.5 支原体试剂盒检测

2.2.6 16SrRNA基因序列的扩增和测序

2.2.7 基因序列的比对分析和进化树的构建

2.2.8 绵羊肺炎支原体原始种子批的建立

2.3 实验结果

2.3.1 病例描述

2.3.2 支原体的分离结果

2.3.3 支原体形态观察

2.3.4 支原体生物化学试验

2.3.5 支原体药敏试验

2.3.6 支原体试剂盒检测

2.3.7 绵羊肺炎支原体的PCR鉴定

2.3.8 16SrRNA基因序列的分析

2.3.9 系统发育树的构建

2.3.10 绵羊肺炎支原体原始种子批的建立

2.4 讨论

第3章 绵羊肺炎支原体HSP70、P30基因的克隆及序列分析

3.1 实验材料

3.1.1 菌株和载体

3.1.2 主要试剂及仪器设备

3.1.3 实验所需溶液配制

3.2 实验方法

3.2.1 绵羊肺炎支原体的复苏与培养

3.2.2 支原体基因组的提取

3.2.3 目的基因的引物设计及合成

3.2.4 HSP70、P30基因的PCR扩增

3.2.5 PCR产物的检测

3.2.6 PCR产物的纯化

3.2.7 PCR产物的回收

3.2.8 HSP70、P30基因的克隆

3.2.9 阳性克隆的筛选

3.2.10 克隆质粒的提取

3.2.11 克隆基因的双酶切鉴定

3.2.12 基因序列的比对分析和进化树的构建

3.3 实验结果

3.3.1 支原体复苏培养

3.3.2 HSP70、P30片段的PCR扩增

3.3.3 HSP70、P30阳性克隆的筛选

3.3.4 连接载体的双酶切鉴定

3.3.5 连接载体的序列测定分析

3.3.6 HSP70、P30基因序列分析

3.3.7 系统发育树的构建

3.4 讨论

第4章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果