猪伪狂犬病病毒河南株的分离鉴定、gE基因克隆与序列分析及原核表达

摘要

参照genbank中公布的minA株PRV gE基因序列(序列号：AY170318)设计了一对特异性引物，通过一系列条件优化建立了PRY的PCR诊断方法。2007年作者从河南省部分发病猪场采集临床症状明显的、疑似PR的病死仔猪内脏和脑组织，利用所建立的PCR方法进行检测，将PRV阳性并且无圆环病毒混合感染的病料接种PK-15细胞，连续传代后均出现与阳性对照一致的典型病变，并且利用PCR方法对细胞培养物进行了鉴定。结果表明，成功分离到4株PRV，且无圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒污染，将分离株分别命名为HNJZ株(焦作株)、HNDF株(登封株)、HNTY株(汤阴株)、HNNY株(南阳株)。 参照genbank中公布的minA株PRVgE基因序列(序列号：AY170318)设计了两对特异性引物，分别用于gE全基因和主要抗原表位基因的扩增，并通过条件优化建立了相应的PCR扩增方法。利用该方法从分离到的HNJZ株中扩增出了gE全基因片段，而从分离到的4株PRY中均扩增出gE主要抗原表位基因片段。将所扩增到的基因片段克隆到PGM-T载体中，通过筛选与鉴定获得了相应的阳性重组质粒，并测序获得了插入片段的基因序列，进行了相应分析。HNJZ株与国内外其他毒株的gE基因序列比对结果显示：不同地域分离株核苷酸同源率达97.3％-99.9％，推导氨基酸序列同源率达94.8％-99.8％，这说明gE基因比较保守；HNJZ株与国内的minA株及韩国的yangshan株同源率最高，而且结合遗传进化分析可知HNJZ株与国内minA株和国外的yangshan株亲缘关系较近；HNJZ株gE基因所编码的氨基酸序列中发生了4处变异，但均不在其主要抗原表位区内。4株河南PRV分离株的gE基因主要抗原表位区的核苷酸同源率和氨基酸同源率均在96％以上，因为4株PRV的分离地在河南省内的跨度较大，所以可以初步推测河南省内不同地方PRY变异很小。而且高度的同源性也进一步说明gE基因主要抗原表位区很保守，这为gE基因主要抗原表位区的表达及相应诊断方法的建立提供了科学的理论依据。 在以上的研究基础之上，根据HNJZ株的gE基因序列，设计了一对引物用于扩增编码gE主要抗原表位的基因片段，并将其克隆到表达载体pET-28a中，构建了gE基因主要抗原表位的原核表达载体。经过筛选与鉴定，获得了阳性转化子，经IPTG诱导表达的产物通过SDS-PAGE电泳检测，表明该融合蛋白得到了表达，且一系列的条件优化使其表达效率得到了提高。经Western-blotting分析，重组蛋白有良好的免疫反应性，为单克隆抗体的制备及诊断方法的建立奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

文献综述

实验一猪伪狂犬病病毒河南株的分离与鉴定

1材料与方法

2结果与分析

3结论与讨论

实验二4株猪伪狂犬病病毒gE基因的克隆与序列分析

1材料与方法

2结果与分析

3结论与讨论

实验三HNJZ株gE基因主要抗原表位原核表达载体的构建及初步表达

1材料与方法

2结果与分析

3结论与讨论

参考文献

附录:主要试剂配制