益肺济生方提取工艺及主要成分抗炎活性研究

摘要

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）以气流受限为特征，具有发病率高和病机复杂等特点，其中炎症反应是 COPD最重要的病理特征，抑制炎症反应成为缓解和治疗 COPD的重要措施。益肺济生方对COPD稳定期有显著疗效，通过对其主要成分的抗炎作用进行研究，以期为益肺济生方组分配伍提供依据。本课题对益肺济生方提取工艺进行研究，其中黄芪等采用水煎煮提取，山茱萸等采用乙醇回流提取，筛选出最优提取工艺；同时采用肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞A549体外细胞炎症模型，探讨该方中主要成分的抗炎作用。　　目的：　　以益肺济生方为研究对象，根据组方药材主要成分的不同，将该方药材进行水煎煮法提取和乙醇回流提取，最终优选该方药的提取工艺；同时采用 TNF-α诱导A549细胞建立细胞体外炎症模型，观察益肺济生方中主要成分对该炎症模型白细胞介素-8（IL-8）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、TNF-α、基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）等因子分泌的影响，探讨主要成分的抗炎作用，为进一步阐明益肺济生方治疗COPD的分子机制提供依据。　　方法：　　1益肺济生方提取工艺研究　　对益肺济生方中黄芪、赤芍、矮地茶等药材用水煎煮法进行提取，采用L9(34)正交设计实验，以黄芪甲苷、芍药苷和岩白菜素的提取转移率为指标，考察加水量、煎煮时间及煎煮次数对提取工艺的影响；对方中山茱萸、五味子等药材用乙醇回流提取，以马钱苷和五味子醇甲提取转移率为指标，考察乙醇浓度、乙醇用量、回流时间和回流次数对醇提工艺的影响，优化提取条件。　　2益肺济生方中主要成分对A549炎症模型的作用　　通过TNF-ɑ刺激A549细胞建立体外炎症模型，MTT法筛选出主要成分对A549细胞作用的浓度范围，将 A549细胞按孔平均分为空白组（完全培养基培养A549细胞）、模型组（完全培养基含TNF-α诱导A549细胞）、实验组（主要成分以4组不同浓度进行给药）进行实验，用酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）法检测IL-8、MMP-9和TNF-α等细胞因子的分泌及变化情况。　　结果：　　1益肺济生方最佳提取工艺　　黄芪等药材采用水煎煮提取，加12倍量水，煎煮2次，每次1h，合并提取液，浓缩；酒萸肉等药材采用乙醇回流提取，加10倍量70%的乙醇溶液，回流2次，每次1 h，回收乙醇，浓缩；合并水提和醇提浓缩液，减压干燥。　　2益肺济生方中主要成分对A549炎症模型的作用　　矮地茶中岩白菜素能显著抑制TNF-α分泌（P<0.01）；槲皮素可明显抑制IL-8分泌（P<0.01），同时抑制MMP-9和TNF-α分泌（P<0.05）；山奈酚能够显著抑制IL-8、MMP-9和TNF-α分泌（P<0.01）。五味子中五味子乙素显著降低IL-8、MMP-9分泌（P<0.01），同时使TIMP-1分泌量和MMP-9分泌量显著升高（P<0.01）。陈皮中川陈皮素对IL-8、MMP-9和TNF-α有不同程度的抑制作用；辛弗林对IL-8有一定的抑制作用（P<0.05），显著抑制MMP-9和TNF-α分泌（P<0.01）；橙皮苷能有效抑制 MMP-9（P<0.05）和 IL-8（P<0.01）分泌。枸杞子中甜菜碱能抑制MMP-9和TNF-α分泌（P<0.01）；枸杞多糖能抑制TNF-α分泌（P<0.05）。浙贝母中贝母素甲对IL-8（P<0.01）、MMP-9（P<0.05）和TNF-α（P<0.05）分泌均起到抑制作用；贝母乙素能显著抑制TNF-α的分泌（P<0.01）。淫羊藿苷能显著抑制IL-8、MMP-9和TNF-α分泌（P<0.01）。黄芪中黄芪多糖对MMP-9（P<0.05）和TNF-α（P<0.01）有一定抑制作用。　　结论：　　1益肺济生方的提取工艺稳定、简便、可控，有利于该方中有效成分的提取，为后期新药研发的制剂工艺奠定基础；　　2益肺济生方中矮地茶中岩白菜素、槲皮素、山奈酚，五味子中五味子乙素，陈皮中川陈皮素、辛弗林、橙皮苷，浙贝母中贝母素甲，淫羊藿中淫羊藿苷以及黄芪中黄芪多糖均能有效抑制IL-8、MMP-9和TNF-α的分泌，具有显著的抗炎作用，为益肺济生方组分配伍的深入研究奠定基础。

目录

声明

前言

第一部分益肺济生方提取工艺研究

材料与方法

1 仪器与试药

2 黄芪等药材水提取工艺研究

3 五味子等药材醇提工艺研究

结果

1 黄芪等水煎煮液提取工艺结果

2 五味子等药材乙醇回流提取工艺结果

小结

第二部分益肺济生方中主要成分对A549细胞炎症模型的作用

材料与方法

1 仪器与试药

2实验方法

结果

1矮地茶主要成分对炎症细胞模型的影响

2五味子主要成分对炎症细胞模型的影响

3陈皮主要成分对炎症细胞模型的影响

4枸杞子主要成分对炎症细胞模型的影响

5浙贝母主要成分对炎症细胞模型的影响

6 淫羊藿主要成分对炎症细胞模型的影响

7黄芪主要成分对炎症细胞模型的影响

小结

讨论

1 益肺济生方提取工艺的优化

1.1提取工艺

1.2指标性成分的选择

2 益肺济生方中主要成分对A549炎症模型的作用

2.1细胞炎症模型的建立

2.2益肺济生方中主要成分的抗炎活性研究

结论

致谢

参考文献

附录一文献综述:中药及复方有效组分配伍研究进展

附录二在校期间论文著作及科研情况