丙酸菌发酵过程分析及发酵培养基优化

摘要

维生素B12是维持正常代谢所必需的水溶性维生素之一，目前大多采用发酵法获得，主要的产生菌有谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)，费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfrudenreichii)和脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)。其中谢氏丙酸菌发酵获得维生素B12过程中，合成维生素B12需要多种氨基酸的共同参与。作为重要前体物质，氨基酸能促进菌体的生长和维生素B12合成。但不同种类和浓度的氨基酸对丙酸杆菌的影响情况不同，所以优化发酵过程中氨基酸的添加策略对促进产物生成具有重要意义。　　本文通过高效液相色谱检测了谢氏丙酸杆菌维生素B12发酵过程中氨基酸、有机酸、维生素B12的变化情况，找到了几种影响VB12产量的关键氨基酸，优化了培养基配方，达到增加谢氏丙酸杆菌维生素B12产量的目的。　　(1)以DNFB作为氨基酸柱前衍生试剂，建立了一种利用反相高效液相色谱法测定丙酸菌发酵液中游离氨基酸的分析方法，并对色谱条件进行了优化，使19种氨基酸在30min内分离效果良好。该分析方法准确、可靠，满足分析要求，并利用该方法检测了谢氏丙酸菌发酵液中游离氨基酸的含量。　　(2)建立了同时检测几种有机酸的高效液相色谱法，采用阳离子交换树脂预处理发酵液，去除杂质峰，处理后样品直接进行液相分析，有机酸组分无损失，获得了同时检测发酵液乙酸、丙酸、琥珀酸的良好效果。　　(3)建立了一种直接测定发酵过程中维生素B12的液相色谱分析方法，以萃取法对胞内维生素B12进行提取，该方法操作简单，准确可靠，并将该法应用于丙酸杆菌发酵液中维生素B12生成量的变化的分析。　　(4)基于液相分析方法，通过对谢氏丙酸杆菌维生素B12发酵过程中氨基酸、有机酸和腺苷钴胺素含量的检测，对谢氏丙酸杆菌维生素B12发酵过程有了更深入的了解，特别是发酵过程发现了多种优先利用的氨基酸。单因素实验表明Tyr、Asn、Asp和Met四种氨基酸单独添加都可以提高10%维生素B12产量，进一步进行正交试验，考察了这几种关键氨基酸对维生素B12产生的影响，结果显示四种氨基酸对维生素B12产量影响顺序为：Tyr＞Asn＞Asp＞Met,发酵培养基中添加Tyr600μg/mL、Asn400μg/mL、Met600μg/mL和Asp400μg/mL，可以使维生素B12产量较对照组提高了17%。

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