FGG基因突变导致遗传性异常纤维蛋白原血症的发病机制研究

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：　　第一部分γAla327Val杂合突变所致的遗传性异常纤维蛋白原血症发病机制研究　　目的:纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)是分子量为340KD的糖蛋白，可相互结合形成纤维蛋白凝块和介导血小板聚集，在维持机体止凝血平衡中发挥着重要的作用。编码Fg的基因出现变异，可引起Fg结构和功能异常，导致遗传性异常纤维蛋白原血症（congenital dysfibrinogenemia，CD），该病临床表现复杂，部分患者表现为血栓或出血，还有的患者可出现出血与血栓并存现象，女性CD患者可出现月经过多、反复流产等症状，但是大部分CD患者无任何临床表现。目前，我们在一例无症状的CD患者中发现了一个新的杂合错义突变(FGG c.1058C＞T)，该突变位点位于FGG基因的8号外显子第327位氨基酸（去除信号肽），为γAla327Val杂合错义突变。我们从患者及其家系另外4位成员血浆中提取出纤维蛋白原，进行一系列的纤维蛋白原功能研究，包括纤维蛋白原聚集试验，纤维蛋白凝块溶解试验，血栓弹力图试验，以及进行纤维蛋白凝块扫描电镜试验，SDS-PAGE电泳试验和氨基酸建模等，以研究突变位点对纤维蛋白原结构和功能可能产生的影响，进而研究FGG c.1058C＞T，γAla327Val杂合突变所致的遗传性异常纤维蛋白原血症的发病机制。　　方法:(1)收集患者及其家系成员基本资料及进行常规凝血功能检查，包括APTT、PT、TT、Fg（Clauss法和免疫比浊法），肝肾功能检查及常规体格检查;(2)提取CD患者外周血细胞DNA，分别设计并且合成外显子上下游引物，采用PCR技术扩增纤维蛋白原基因的所有外显子，检测扩增目的片段碱基序列，测序结果比对NCBI基因数据库中的Fg基因标准序列，查找CD患者的基因突变位点;(3)对CD患者及正常对照血浆纤维蛋白原的聚集过程进行动态监测，了解CD患者的纤维蛋白原聚集功能;(4)对CD患者及正常对照血浆纤维蛋白凝块的溶解过程进行动态监测，了解CD患者的纤维蛋白溶解过程是否存在纤溶延迟或纤溶抵抗现象;(5)运用血栓弹力仪监测先证者及其家系成员的凝血功能;(6)提取及纯化先证者及其家系成员的血浆纤维蛋白原，进行SDS-PAGE电泳，明确纤维蛋白原是否存在变异条带;(7)通过扫描电子显微镜观察先证者纤维蛋白凝块的网络结构;(8)通过氨基酸建模分析突变位点对纤维蛋白原的影响。通过以上方法，初步探讨γAla327Val突变导致的遗传性异常纤维蛋白原血症的分子发病机制。　　结果:(1)先证者及其家系成员日常生活中没有发生异常出血或血栓形成，实验室常规凝血功能检测发现先证者及其家系成员纤维蛋白原活性浓度（Clauss法）明显低于纤维蛋白原抗原浓度（免疫比浊法），肝肾功能检查结果无异常。(2)通过基因测序并比对NCBI基因数据库内标准序列发现，先证者及其家系成员FGG基因第8号外显子均发生FGG c.1058C＞T杂合错义突变，导致γAla327Val杂合突变。(3)纤维蛋白原聚集试验的结果发现，相对于正常对照，先证者及其家系成员纤维蛋白原聚集曲线的OD值上升幅度小，且最大OD值（平均为0.283Abs），均比正常对照(0.422Abs)低，提示先证者及其家系成员纤维蛋白聚集速率减慢，纤维蛋白聚集有所缺陷。(4)纤维蛋白凝块溶解试验结果发现，先证者及其家系成员的纤维蛋白原样本最大OD值均比正常对照低，凝块浊度平均在496秒后开始下降（正常对照:660秒），上述结果表明先证者及其家系成员相对于正常对照而言，凝块溶解过程未出现纤溶延迟及抵抗现象。(5)血栓弹力图(TEG)检测结果发现先证者及其家系成员的K值增大，平均值为3.7min(正常对照为2.3min)，其相应的Angle值减小，平均值为52.8°（正常对照为61.5°），提示先证者及其家系成员的纤维蛋白原功能低下，血凝块聚合的速率减低。(6) SDS-PAGE电泳结果显示，先证者及其家系成员的纤维蛋白原未发生迁移率改变。(7)扫描电子显微镜下观察先证者的纤维蛋白凝块网络结构，显示纤维丝大小不一，排列不规则，纤维丝末端卷曲成团。纤维网络空间结构疏松，网络孔径增大，纤维分支节点较正常对照多。(8)通过对突变氨基酸建模分析发现，γAla327Val突变导致纤维蛋白原D区空间结构发生变化，影响其结构稳定性。　　结论:1.结合先证者及该家系成员各项检测数据，我们诊断该家系为遗传性异常纤维蛋白原血症，γ链FGG基因八号外显子Ala327Val杂合错义突变为该家系CD患者致病突变位点。该突变是首次在国内外报道。2.纤维蛋白原γ链Ala327Val杂合突变，导致纤维蛋白原结构异常，聚集功能受损。　　第二部分 运用血栓弹力图评估γArg275突变引起遗传性异常纤维蛋白原血症患者的凝血功能　　目的:血栓弹力图(thromboelastography, TEG)是一种通过采集全血样本，在体外模拟人体的内环境，激活凝血系统，动态分析血块形成和纤维蛋白溶解（纤溶）全过程的凝血检测。目前，TEG应用于CD的研究非常少，而CD致病机制复杂，CD患者临床表现多样，常规的凝血功能检测对CD患者的检测比较片面、单一，而应用TEG可以全方位评估CD患者机体凝血功能，对遗传性异常纤维蛋白原血症的诊断、鉴别诊断和评估患者凝血功能有很大价值。本研究应用TEG对γArg275突变导致的CD患者进行检测，探究该突变对CD患者凝血功能的影响。　　方法:本研究共收集了24例γArg275突变导致的CD患者及84例正常对照组，应用TEG进行凝血功能检测，探究该突变对CD患者凝血功能的影响。同时，对γArg275突变导致的CD患者进行常规凝血功能检测，包括APTT、PT、TT、Fg（Clauss法和PT-衍生法），肝肾功能检查;提取CD患者外周血细胞DNA，扩增纤维蛋白原基因全外显子并检测其碱基序列;对CD患者血浆纤维蛋白原的聚集过程进行动态监测，了解CD患者的纤维蛋白原聚集功能;进行氨基酸建模分析γArg275突变位点。　　结果:TEG检测结果显示，与对照组相比，实验组的K值明显延长(4.04±1.20 vs2.06±0.46min，P＜0.05)，Angle值明显减小(49.10±7.55 vs60.76±8.75°，P＜0.05)，提示实验组CD患者血凝块聚合的速率降低，纤维蛋白原功能低下。常规凝血功能检测结果显示，实验组血浆TT值明显延长(31.83±4.33s，参考范围为9-15s)，纤维蛋白原浓度（Clauss法）明显低于PT-衍生法(0.62±0.17 vs3.87±0.96g/L，P＜0.05，参考范围为2-5 g/L)。实验组CD患者肝肾功能均无异常。通过基因测序检测发现，实验组基因突变位点为γArg275，突变类型有γArg275Cys和γArg275His。纤维蛋白原聚集结果显示，与正常对照相比，相同时间内，实验组纤维蛋白原聚集曲线的OD值上升幅度小，且最大OD值（平均为0.20Abs），均比正常对照(0.32Abs)低，提示实验组纤维蛋白原聚集速率慢，纤维蛋白原聚集有所缺陷。氨基酸建模分析发现，γArg275突变影响其所在的β折叠二级结构及蛋白质结构发生局部变化，影响其结构稳定性。　　结论:运用血栓弹力图评估γArg275突变引起遗传性异常纤维蛋白原血症患者的凝血功能，结果显示，纤维蛋白原聚集功能障碍。

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个人简历

摘要

前言

第一部分γAla327Val杂合突变所致的遗传性异常纤维蛋白原血症分子发病机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分运用血栓弹力图评估γAr9275突变引起遗传性异常纤维蛋白原血症患者的凝血功能

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录英文缩略语表

综述 遗传性异常纤维蛋白原血症实验室检查研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文