微小RNA-206及其靶基因GJA1（间隙连接蛋白43基因）在激素性股骨头坏死中的作用研究

摘要

目的：　　目的：　　miRNA是生物体内源长度约为21个核苷酸左右的非编码小RNA，通过与靶mRNA分子3'末端非翻译区域(3'-untranslated region，3'UTR)互补配对而在转录水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的翻译抑制或者降解从而发挥生物调控功能[1]。现有研究表明骨组织的发生、生长、代谢同样与miRNA有着密切的关联。连接子蛋白43(connexin43，Cx43)是骨组织中主要的间隙连接(gap junction)蛋白和半通道(hemichannel)蛋白，由Cx43形成的间隙连接及半通道实现了骨组织细胞间的直接通讯，对骨组织的正常发育、骨重建过程的建立与平衡起重要作用[2，3]。已有研究表明miRNA-206以间隙连接蛋白43为靶基因对成骨细胞的生物学行为产生影响[4]。而成骨细胞是骨发育重建过程中最重要细胞之一，在骨骼发育成熟和修复重建中具有重要作用，其数量、功能的改变与股骨头坏死密切相关[5,6]。我们假设激素性股骨头坏死的病理发生发展与Cx43/miRNA-206调控的成骨细胞分化通路相关。本实验以miRNA-206为中心，从分子生物学水平、细胞水平对Cx43/miRNA-206调控的成骨细胞分化通路在激素性股骨头坏死中的作用深入研究，为研究激素性股骨头缺血性坏死的发病机制提供新的思路。　　方法与结果：　　一、miRNA-206及其靶基因GJA1（间隙连接蛋白43基因）在激素性股骨头坏死骨组织中的表达变化　　方法:　　(1)收集激素性股骨头坏死与股骨颈骨折行全髋置换手术患者的股骨头标本46例，其中激素性股骨头缺血性坏死（实验组）26例;新鲜股骨颈骨折（对照组）20例　　(2)HE染色观察两组股骨头组织形态变化　　(3)免疫组织化学检测CX43蛋白在股骨头的表达　　(4)提取患者股骨头总RNA实时荧光定量PCR检测两组股骨头miRNA-206及CX43mRNA的表达情况　　(5)提取患者股骨头总蛋白质，western blot定量检测股骨头CX43蛋白的表达　　结果:　　(1)HE染色:实验组:骨小梁坏死，细胞核消失，骨髓造血及微循环障碍;对照组:骨小梁内有少量坏死骨细胞，骨髓腔造血细胞增生活跃。　　(2)免疫组化:Cx43蛋白阳性表达于骨细胞、成骨细胞及细胞与细胞之间的胞膜和胞浆上。　　(3)荧光定量PCR:miRNA-206在实验组的表达量是对照组的4.3倍，两组具有统计学差异(P＜0.05)，CX43mRNA在对照组的表达是实验组的2.4倍，两者间具有统计学差异(P＜0.05)。　　(4)Western blot: CX43蛋白的表达在实验组中低于对照组，两者具有统计学差异(P＜0.05)。　　二、miRNA-206通过抑制Cx43的表达而参与成骨细胞的调控　　方法:　　(1)成骨细胞株人SV40转染成骨细胞株购于（中国科学院细胞库）;　　(2)向原代成骨细胞内转染miRNA-206的mimic（模拟剂）和inhibitor（抑制剂）及阴性对照N.C;　　(3)采用qRT-PCR检测miRNA-206、Cx43的mRNA表达及Western-blot方法检测Cx43蛋白表达水平，CCK-8法检测细胞增殖能力，ALP底物显色反应来评价转染后成骨细胞功能变化。　　结果:　　(1)转染miRNA-206 mimic后，细胞中miRNA-206表达明显增加，Cx43蛋白表达下降，与阴性对照比较具有统计学差异(P＜0.05)，Cx43mRNA表达不变，与阴性对照比较无统计学差异(P＞0.05);成骨细胞数量与N.C.对照组相比均显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05);成骨细胞特异性分化标志物ALP活性下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　(2)转染miRNA-206inhibitor后，细胞中miRNA-206表达明显下降，Cx43蛋白表达增加，与阴性对照比较具有统计学差异(P＜0.05)Cx43mRNA表达不变，与阴性对照比较无统计学差异(P＞0.05);成骨细胞数量与正常对照组和N.C.对照组相比均显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);成骨细胞增殖能力增强，成骨细胞特异性分化标志物ALP活性增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　结论:　　(1)在激素性股骨头坏死骨组织中，miRNA-206表达上调，CX43表达下调;　　(2)miRNA-206通过抑制Cx43的表达，从而抑制成骨细胞增殖、分化;　　(3)miRNA-206可能通过调控其靶基因CAJ1目的蛋白Cx43表达调控成骨细胞增殖、分化进而参与的激素性骨头坏死的发生与发展。

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摘要

前言

第一部分 miRNA-206及其靶基因GJA1(间隙连接蛋白43基因)在激素性股骨头坏死骨组织中的表达变化

一、实验标本及方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 Cx43／miRNA-206对成骨细胞的调控研究

一、实验材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三部分 综述

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文