地衣、枯草芽孢杆菌产酶能力分析及在辣木叶发酵中的应用

摘要

辣木（Moringa）是一种原产于印度的高产木本饲料树种，具有丰富的营养物质和高效的生物活性。同时辣木抗营养因子含量比较多，难以被直接吸收、利用，适口性也比较差。微生物发酵技术可以有效地改善辣木营养水平以及适口性。其机理是微生物利用自身代谢产生的多种生物酶，将原料中所含的多种难以吸收的营养物质经过降解或合成，产生利于畜禽消化、吸收的高营养物质成分。在饲料发酵生产中，获得高效的微生物发酵菌株，可通过两种途径实现，一种是筛选高产酶菌株，另一种为优化菌株产酶生长条件。　　本研究以国家农业部公布的可饲喂的地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌为研究对象，分析两株芽孢杆菌培养过程中，菌种接种量、培养时间、培养基营养丰富程度以及盐度对菌株的产酶性能的影响，以优化两种常用芽孢杆菌菌株的培养条件和培养基组成，研究结果表明，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在培养时间为32 h，接种量为2%，培养基氮源为1.5%，盐度为1%时综合产酶能力较强，其中地衣芽胞杆菌发酵液纤维素酶酶活力约为12 U/mL，蛋白酶酶活力为29.069 U/mL，淀粉酶酶活力为57.588 U/mL。枯草芽孢杆菌发酵液纤维素酶酶活力为12.520 U/mL，蛋白酶酶活力为87.185 U/mL，淀粉酶酶活力为685.129 U/mL。　　为进一步研究菌株培养条件对菌株代谢通路的影响，本研究应用0%、1%与3%三种盐度培养枯草芽孢杆菌，并测定了不同盐度培养菌株的GC-MS代谢组。GC-MS代谢组学研究结果表明，从0%、1%、3%三种不同盐度下培养的枯草芽孢杆菌中分别鉴定出11种、41种、35种不同的代谢物质。通过查询KEGG数据库，对不同盐度下鉴定出的代谢产物进行代谢通路分析，发现三种不同盐度下所鉴定出的代谢产物参与碳水化合物代谢的分别有2种、4种、6种；参与氨基酸代谢的分别有5种、14种、16种；参与核苷酸代谢的分别有0种、3种、1种；参与脂类代谢的分别有1种、4种、3种。此外，1%盐度下所鉴定出的代谢产物还参与了能量代谢。　　进一步的以辣木叶为底物，应用两株菌株进行辣木叶的饲料发酵实验，研究结果表明，经过地衣芽胞杆菌发酵后，辣木叶的可溶性蛋白含量增加76.6%，还原糖含量增加了16倍。应用枯草芽孢杆菌发酵液发酵后，辣木叶的可溶性蛋白含量增加92.7%，还原糖含量增加3倍，纤维素含量降低14.38%，16种游离氨基酸中有10种氨基酸含量上升，4种氨基酸含量下降，2种氨基酸没有变化。其中必需氨基酸的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸与赖氨酸的含量分别上升5.88%、5.13%、12.90%、12.12%与10.63%，苏氨酸含量下降2.56%，其他氨基酸中谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、酪氨酸与脯氨酸含量均有增加，蛋氨酸、组氨酸与甘氨酸的含量均下降。　　以上研究为通过改善菌株培养条件提高菌株产酶性能提供理论依据，并为这两种芽孢杆菌应用于辣木发酵提供参考数据。

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1 引言

1.1 辣木的研究

1.1.3 辣木的营养价值

1.1.4 辣木的开发与利用

1.2 发酵饲料的研究

1.2.1 发酵饲料

1.2.2 发酵饲料的作用

1.3 饲用微生物的种类及作用

1.4 芽孢杆菌

1.4.1 地衣芽孢杆菌

1.4.2 枯草芽孢杆菌

1.5 微生物酶

1.5.1 纤维素酶

1.5.2 蛋白酶

1.5.3 淀粉酶

1.6 微生物代谢组学

1.6.2 代谢组学的研究技术

1.6.3 微生物代谢组学

1.7 研究的意义与目的

1.7.1 研究目的与意义

1.7.2 技术路线

2.1 实验材料

2.1.1 菌种

2.1.2 常用培养基

2.1.3 实验试剂配置

2.1.4 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 菌种的活化

2.2.2 菌株的培养

2.2.3 粗酶液的制备

2.2.4 菌株酶活定性实验

2.2.5 菌株酶活定量实验

2.2.6 菌株的代谢组学实验

2.2.7 辣木发酵实验

3 结果与分析

3.1 菌株酶活定性实验

3.1.1 菌株淀粉酶定性试验结果

3.1.2 菌株蛋白酶定性实验结果

3.1.3 菌株纤维素酶定性实验结果

3.2 菌株酶活定量实验

3.2.1 菌株生长曲线

3.2.2 标准曲线

3.2.3 时间对菌株产酶能力的影响

3.2.4 接种量对菌株产酶能力的影响

3.2.5 氮源对菌株产酶能力的影响

3.2.6 盐度对菌株产酶能力影响

3.3 菌株的代谢组学实验

3.3.1 枯草芽孢杆菌盐度为0 %时GC-MS检测

3.3.2 枯草芽孢杆菌盐度为1 %时GC-MS检测

3.3.3 枯草芽孢杆菌盐度为3 %时GC-MS检测

3.3.4 不同盐度对枯草芽孢杆菌代谢产物的影响

3.3.5 不同盐度对枯草芽孢杆菌代谢途径的影响

3.4 辣木饲料发酵实验

3.4.1 辣木叶微生物发酵的感官评价

3.4.2 辣木发酵饲料可溶性蛋白含量

3.4.3 辣木发酵饲料还原糖含量

3.4.4 辣木叶发酵饲料粗纤维含量测定

3.4.5 辣木叶发酵饲料氨基酸含量测定

4 讨论

4.1 两种菌株产酶能力分析与优化

4.2 不同盐度对枯草芽孢杆菌代谢通路的影响

4.3 两种芽孢杆菌辣木发酵效果

5 结论

6 展望

致 谢

参考文献

附录

附录A 碳代谢途径

附录B 氨基酸代谢途径

附录C 脂类代谢途径

附录D 核苷酸代谢途径

附录E 能量代谢途径