铜通过ROS介导的caspase-1途径诱导鸡肝细胞焦亡

摘要

为了探讨铜是否能诱导肝细胞发生焦亡及其发生机制，本研究通过培养鸡原代肝细胞，以不同浓度的硫酸铜（0、10、50、100μmol/L）处理细胞24 h。CCK-8法检测肝细胞的相对活力，实时荧光定量PCR检测细胞焦亡的相关基因caspase-1、IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA转录水平，使用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）与铜共同作用肝细胞，观察上述四个指标的变化。酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞上清液中焦亡相关蛋白caspase-1、IL-1β、IL-18 的含量，使用caspase-1 抑制剂Z-YVAD-FMK与铜共同作用于肝细胞后观察上述三个指标的变化，生化检测培养上清液中丙氨酸氨基转移酶（ALT），天门冬氨酸氨基转移酶（AST），乳酸脱氢酶（LDH）的活性，可以根据此评价检测肝细胞受损程度，探究活性氧清除剂对肝细胞焦亡的影响。最后用实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因Bax，caspase-3，CytC，P53，研究抑制焦亡对凋亡的影响。结果表明：　　（1）铜可诱导焦亡相关基因caspase-1、IL-1β、IL-18、NLRP3的mRNA表达显著上调（P＜0.01），相关蛋白含量也显著升高（P＜0.01）。　　（2）NAC与铜联合作用可使肝细胞焦亡相关基因表达显著下调（P＜0.01），相关蛋白含量也显著降低（P＜0.01）。　　（3）铜（100μmol/L）联合YVAD作用肝细胞后，与100μmol/L Cu2+组细胞活力相比，其相对活力显著升高（P＜0.01）。与对照组正常细胞相比，100μmol/L Cu2+组肝细胞上清液中的ALT，AST，LDH等含量显著升高（P＜0.01）。YVAD与铜联合作用可使肝细胞焦亡相关基因caspase-1 表达显著下调（P＜0.01），相关蛋白含量也显著降低（P＜0.01）。　　（4）与对照组相比，凋亡相关基因Bax，caspase-3，CytC，P53的100μmol/L Cu2+组mRNA表达量差异极显著（P＜0.01），100 μmol/L Cu2+联合YVAD组的mRNA相对表达量下降，差异极显著（P＜0.01）。　　结论：铜可以诱导肝细胞发生焦亡，焦亡的发生可能是通过ROS介导的，YVAD可抑制铜对肝细胞的损伤作用，抑制肝细胞的焦亡可以降低凋亡相关基因 mRNA 的表达水平。

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