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第一章 绪论
1.1脂肪酶简介
1.2微生物脂肪酶
1.2.1 细菌脂肪酶
1.2.2真菌脂肪酶
1.3脂肪酶异源表达概述
1.3.1脂肪酶在大肠杆菌的重组表达
1.3.2脂肪酶在毕赤酵母的重组表达
1.4 毕赤酵母表达系统概述
1.4.1 毕赤酵母表达系统简介
1.4.2毕赤酵母表达元件简介
1.4.3毕赤酵母表达宿主简介
1.4.4酵母表达系统蛋白胞外分泌途径
1.4.5外源蛋白在毕赤酵母高效表达策略
1.5脂肪酶温度优化
1.5.1 提升脂肪酶热稳定性
1.5.2 提升脂肪酶在低温条件下的酶活性
1.6.1造纸领域
1.6.2 畜禽养殖领域
1.6.3结构脂领域
1.6.4 生物柴油领域
1.6.5手性拆分合成生物医药中间体
1.7.1研究背景和意义
1.7.2研究内容
第二章 不同启动子对TDL 在毕赤酵母表达的影响
2.1.1主要实验材料
2.1.2 主要仪器与设备
2.1.3培养基及溶液的配制
2.2实验方法
2.2.1 毕赤酵母X33基因组提取
2.2.2大肠杆菌Top10感受态细胞制备
2.2.3 不同启动子表达载体构建
2.2.4毕赤酵母感受态细胞的制备
2.2.5 重组酵母工程菌种的构建及筛选
2.2.6 重组工程菌的高密度发酵
2.2.7 分析检测方法
2.3结果和分析
2.3.1TDL在不同甲醇诱导型启动子下的表达
2.3.2 TDL在不同组成型启动子下的表达
2.4本章小结：
第三章 不同信号肽对TDL 在毕赤酵母表达的影响
3.1 材料与仪器
3.1.1主要实验材料
3.1.2 主要仪器与设备
3.1.3培养基及溶液的配制
3.2实验方法
3.2.1毕赤酵母X33基因组提取
3.2.2大肠杆菌Top10感受态细胞制备
3.2.3不同异源信号肽表达载体构建
3.2.4同源信号肽表达载体构建
3.2.5 α-MF信号肽及其突变体表达载体构建
3.3结果与分析
3.3.1 TDL在异源信号肽下的表达
3.3.2 TDL在同源信号肽下的表达
3.3.3 α-MF信号肽密码子优化对TDL表达的影响
3.3.4 α-MF信号肽删减突变
3.3.5 α-MF增加序列突变
3.3.6优化信号肽蛋白酶Kex2切割位点
3.3.7综合摇瓶比较分析
3.3.8重组菌D57-74高密度发酵
3.4本章小结
第四章 组合策略提升重组TDL 在毕赤酵母的表达
4.1.1主要实验材料
4.1.2主要仪器与设备
4.1.3培养基及溶液的配制
4.2实验方法
4.2.1多拷贝重组TDL工程菌构建及筛选
4.2.2分子伴侣蛋白共表达
4.2.3 高密度发酵条件优化
4.2.4 重组工程菌大规模发酵
4.3.1 TDL多拷贝重组工程菌构建及筛选
4.3.2 单分子伴侣蛋白共表达
4.3.3 双分子伴侣蛋白共表达
4.3.4高密度发酵优化
4.3.5 大规模高密度发酵培养
4.4本章小结
第五章 理性设计优化TDL 温度特性
5.1.1主要实验材料
5.1.2主要仪器与设备
5.1.3培养基及溶液的配制
5.2实验方法
5.2.1 TDL结构分析及分子建模
5.2.2 去糖基化降低TDL最适反应温度
5.2.3 去二硫键降低TDL最适反应温度
5.2.4 增加二硫键突变体提升重组TDL热稳定性
5.2.5 点突变提升重组TDL热稳定性
5.2.6 组合突变提升重组TDL热稳定性
5.3.1 TDL结构分析及分子建模
5.3.2去糖基化降低重组TDL最适反应温度
5.3.3去二硫键降低重组TDL最适反应温度
5.3.4理性设计二硫键提升TDL热稳定性
5.3.5定点突变提升重组TDL热稳定性
5.3.6 组合突变
5.4本章小结
第六章TDL及其突变体初步应用研究
6.1材料与仪器
6.1.1主要实验材料
6.1.2主要仪器与设备
6.2实验方法
6.2.1 TDL及其突变体N55D在造纸脱墨的初步应用
6.2.2 TDL及其组合突变体5在肉鸡养殖的初步应用
6.3.1 TDL及其突变体N55D在造纸脱墨的初步应用
6.3.2 TDL及其组合突变体5在肉鸡养殖的初步应用
6.4 本章小结
结论与展望
一、结论
二、本研究的创新点
三、前景与展望
参考文献
攻读博士学位期间取得的研究成果
致谢
答辩决议书
华南理工大学;
