非受体酪氨酸激酶c-Abl调节微管组装的机理研究

摘要

非受体型酪氨酸激酶c-Abl是Abelson鼠白血病病毒v-abl原癌基因在哺乳动物细胞内的同源基因，在哺乳动物中广泛表达。C-Abl蛋白具有丰富的结构域，其中SH3结构域能特异地识别富含脯氨酸残基的蛋白区域，SH2结构域能特异地识别可被磷酸化的酪氨酸序列。通过NLS和NES结构在细胞核和细胞质之间进行穿梭，使之定位于不同的亚细胞结构。绝大多数胞质c-Abl通过其C端与G/F-肌动蛋白细胞骨架相连，从而调节F-肌动蛋白依赖的细胞骨架的变化。C-Abl在正常生理及病理条件下具有多种生物学功能，参与细胞周期调控、细胞黏附迁移和细胞凋亡调控，并在氧化应激和DNA损伤修复过程中发挥重要的作用。
　　 微管是一种细胞骨架结构，主要由微管蛋白α/β二聚体组成，具有支持细胞结构、固定细胞器位置的作用，并参与构成纤毛与鞭毛、神经细胞轴突，另外还是中心体和纺锤体的重要组成部分。纺锤体在有丝分裂过程发挥着极其重要的作用，在有丝分裂期牵引染色体的移动并介导姐妹染色体的分离，在有丝分裂末期引导收缩环的形成从而促进胞质分裂。
　　 PLK1和FOXM1是两个与细胞周期有关的蛋白，它们都呈现细胞周期依赖性表达。FOXM1是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子，属FOX蛋白家族，主要参与细胞周期特异性基因的调节，促进细胞增殖，它的表达和活性受许多增殖信号和抗增殖信号的调节。PLK1属于Polo样激酶家族，是一类广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞周期调节、细胞增殖、肿瘤发生等方面有重要作用。它们都参与中心体和纺锤体的形成。FOXM1是PLK1激酶的底物，FOXM1也可以调节PLK1的表达，二者通过相互作用调节一系列细胞周期蛋白和因子，共同影响细胞周期。
　　 本研究通过免疫沉淀和免疫印迹证实，c-Abl可以与PLK1相互作用，并磷酸化PLK1，因此PLK1是c-Abl激酶的底物。还通过细胞周期同步化的方法发现它们之间的相互作用以及c-Abl对PLK1的磷酸化都是随细胞周期进程的变化而变化的。还通过荧光定量PCR和报告基因检测技术证实c-Abl可以促进FOXM1的转录；通过脉冲追踪实验证实c-Abl可以抑制FOXM1的降解；通过免疫印迹的方法证明c-Abl可提高FOXM1的蛋白水平，且这种作用依赖于c-Abl的激酶活性。因此c-Abl激酶通过与其底物PLK1相互作用并调节其磷酸化而间接影响了FOXM1的表达和蛋白稳定性。
　　 本研究中分离了聚合和溶解状态的微管蛋白，通过免疫印迹的方法检测了它们的蛋白水平，发现c-Abl敲低后溶解状态的微管所占比例升高，而聚合状态所占微管的比例下降；又通过非变性PAGE胶分离了生理状态的微管，发现c-Abl敲低后微管的聚合程度明显下降，这说明c-Abl能够抑制微管的解聚。还通过免疫荧光技术发现c-Abl敲低后细胞的微管结构变得模糊和弥散，说明c-Abl缺陷影响了微管的组装。另外我们还用免疫印迹的方法比较了c-Abl敲低细胞中微管蛋白的水平，发现与野生型细胞相比，c-Abl敲低后微管蛋白的量明显下降，这说明c-Abl可抑制微管蛋白的降解。
　　 C-Abl对微管聚合和组装的影响势必影响纺锤体的组装。我们通过免疫荧光技术对有丝分裂期纺锤体进行了免疫荧光染色，发现c-Abl敲低后纺锤体的组装出现缺陷。还发现非分裂期的c-Abl敲低细胞系中有许多多核细胞出现，这说明c-Abl缺陷影响了胞质分裂的正常进行。
　　 本研究发现了一个新的c-Abl底物PLK1，并初步证实c-Abl通过与PLK1相互作用和对PLK1进行磷酸化，进而通过多个途径对细胞周期进行调节。C-Abl通过调节转录因子FOXM1的表达和活性，从而调节G2/M期特异性基因的转录；通过调节与纺锤体组装有关的PLK1底物对有丝分裂期进行调控；通过调节与胞质分裂有关的PLK1底物对胞质分裂进行调控。鉴于微管组装在细胞有丝分裂中的重要作用，本研究为深入认识Abl家族酪氨酸激酶在细胞周期调控中的作用提供了新的依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

第1章 引 言

第2章 材料与方法

第3章 结 果

第4章 讨 论

第5章 结 论

参考文献

附录

致 谢

硕士期间发表论文