基于STAT3和NF-κB双信号抗肿瘤药物高通量筛选平台的建立及应用

摘要

STAT3和NF-κB是迄今为止研究最为透彻的、与肿瘤相关一系列信号转导分子中的重要成员，几乎参与了肿瘤发生的所有过程，包括细胞增殖、存活、血管生成、转移等关键步骤。在结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、胃癌等众多恶性肿瘤中，都有持续活化的STAT3和NF-κB活性。大量证据表明，通过特异性抑制STAT3和/或NF-κB信号，能下调与肿瘤相关效应蛋白的表达量，在很大程度抑制肿瘤细胞的生存、增殖和迁移。此外，也有证据表明肿瘤微环境中其它类型细胞异常升高的STAT3和NF-κB活性，对肿瘤的进程起了促进作用，抑制这部分细胞中STAT3和NF-κB活性，有时也能较好地抑制肿瘤发展，提高肿瘤患者的预后水平。因此，建立高效的、基于STAT3和NF-κB信号的高通量药物筛选系统，并应用于相应抑制剂的筛选，将为相关抗肿瘤药物的开发提供理想的候选产物。　　首先我们建立了基于STAT3和NF-κB双信号的抗肿瘤药物筛选平台并应用于药物筛选。本论文通过EMSA及Western-Blot实验，与正常细胞相比较，挑选出一系列具有组成型STAT3和NF-κB活性的肿瘤细胞系，并摸索出最佳的STAT3和NF-κB响应元件比例(16∶1)，使报告系统载体能够适用于其中的A549细胞系，构建成利用荧光素酶报告基因的高通量药物筛选平台；所得细胞株对STAT3和NF-κB信号改变都有良好的响应，能够用于筛选STAT3信号抑制剂、NF-κB信号抑制剂或同时阻断STAT3和NF-κB信号的抑制剂。通过对中草药提取物、天然产物单体等资源的筛选，得到多种具有信号抑制活性的产物，即能抑制STAT3和/或NF-κB信号的小分子化合物；在筛药过程中该药物筛选平台的使用方法得到了完善。　　本课题对天然产物库中筛选得到的活性小分子进行了细胞水平的初步验证。主要通过Westem-Blot确认它们对STAT3及NF-κB蛋白活性的抑制。其中天然产物BrevilinA具有STAT3抑制活性，并呈现出特异性高、细胞毒性低的特点。进一步研究发现，对于STAT3信号依赖的肿瘤细胞DU145及MDA-MB-468，Brevilin A能有效抑制它们持续活化的STAT3活性，下调STAT3所调控的细胞存活及周期相关蛋白表达（如c-Myc和CyclinD1），从而抑制细胞生长并促进凋亡；而对于正常来源的细胞，Brevilin A具有较小的杀伤性。　　深入研究表明Brevilin A特异性作用于STAT3上游，抑制JAKs家族成员的活性。BrevilinA阻断了包括IL-6、IFNs在内细胞因子对JAK-STAT信号的诱导活化；同时，Brevilin A也能特异性抑制JAKs-JHI酪氨酸激酶结构域过表达所诱导的STATs活化(包括STAT3和STAT1)，而对Src激酶过表达诱导的底物磷酸化无明显抑制。以Tyk2-JH1及人重组STAT3蛋白为代表的体外激酶实验进一步证实，Brevilin A能直接作用于JAKs家族JH1酪氨酸激酶结构域，从而阻止其催化底物蛋白。体外细胞迁移实验和Matrige1克隆形成实验都证明Brevilin A对相关肿瘤进程具有良好的抑制作用。　　Brevilin A阻断JAKs活性的结果说明该化合物不但可以作为STAT3信号抑制剂，还可以用来抑制其它超活化的JAK-STAT信号。关于Brevilin A的结果将有助于开发特异性JAK-STAT抑制剂（或药物），从而提高具有超活化STATs和JAKs相关病人的生存质量。

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