牛乳铁蛋白多肽及突变体在大肠杆菌中融合表达

摘要

目的：获得正常LfcinBDNA序列，依据相关的文献报道，寻找合适的突变位点，并将天然型(LfcinB)与突变(mLfcinB)分别在大肠杆菌中融合表达，初步测定天然型肽的抗菌活性，为进一步研究LfcinB结构与功能的关系奠定基础。 方法：根据Genebank中登录的LfcinBDNA序列及大肠杆菌偏爱的密码子设计LfcinBDNA序列。依据相关的文献报道，寻找合适的突变位点，将LfcinBDNA序列中第4位精氨酸密码子CGT、第10位甲硫氨酸密码子ATG均突变为色氨酸密码子TGG。将天然型与突变体分别与克隆载体pUC-18连接、转化大肠杆菌DH5α，经蓝白筛选，挑取阳性菌落，抽提重组质粒鉴定后测序。测序正确后将阳性重组质粒和融合表达载体pGEX-4T-1经EcoRI和SalI双酶切，16℃连接、转化大肠杆菌BL21，挑取菌落，抽提重组质粒鉴定并测序。将鉴定为阳性的菌落用IPTG37℃诱导表达2～5小时，全菌体蛋白SDS-PAGE电泳观察表达结果。将表达的含融合蛋白的大肠杆菌BL21经超声波破碎细菌，SDS-PAGE电泳观察得到的融合蛋白是否以包涵体形式存在。用凝血酶切割融合蛋白，Glutathione-Sepharase4B亲和层析柱纯化。最后用抑菌圈实验初步鉴定天然肽的抗菌活性。 结果：1.化学合成的LfcinBDNA片段与克隆载体PUC-18连接并测序，结果表明与预先设计的LfcinBDNA序列一致。 2.依据LfcinB结构及相关文献资料设计突变位点，克隆后测序结果表明LfcinBDNA序列中第4位精氨酸密码子CGT、第10位甲硫氨酸密码子ATG均突变为色氨酸密码子TGG，达到预期突变结果。 3.LfcinB基因及mLfcinB分别与与融合表达载体连接、转化大肠杆菌BL21，抽提重组质粒鉴定，测序结果表明LfcinB基因及mLfcinB基因与融合表达载体连接方向正确，可以进行诱导表达。 4.经IPTG诱导表达2～5小时后，SDS-PAGE电泳结果可见29KD的融合蛋白条带。表达的融合蛋白经超声波破碎细菌，上清和沉淀经SDS-PAGE电泳，表明融合蛋白以包涵体形式存在。经包涵体的溶解、变性和复性、纯化，得到可溶形式的融合蛋白。 5.用凝血酶对融合蛋白切割分离GST-LfcinB蛋白、GST-mLcinB纯化后对LfcinB蛋白的抗菌活性用抑菌圈实验鉴定，表现出对金黄色葡萄球菌ATCC25938的抗菌作用。 结论：成功构建了LfcinB成熟肽及突变体，并在大肠杆菌中诱导表达成功，经纯化后，获得了具有抗菌活性的LfcinB多肽。为下一步突变蛋白抗菌活性的定量测定及与LfcinB蛋白抗菌活性的比较、真核表达奠定了基础。

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文摘

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前言

1实验材料

2实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

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