高表达的长链非编码RNA CASC9通过激活AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬及自噬介导的凋亡从而促进口腔鳞癌发展

摘要

背景：近年研究显示lncRNA CASC9在多种肿瘤中表达升高，发挥重要的促癌作用。然而， CASC9 在口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma , OSCC) 中的表达及其生物学功能尚不清楚。　　目的：研究CASC9在OSCC中的表达和临床意义，并在体内外验证CASC9的生物学功能。　　方法：用RT-qPCR检测 35例配对口腔鳞癌和癌旁组织中CASC9的表达水平。用RT-qPCR检测OSCC细胞系和正常口腔黏膜细胞系中CASC9的表达水平。用原位杂交检测具有完整临床资料和随访资料的84例口腔鳞癌患者标本中CASC9的表达水平，分析CASC9的表达水平与口腔鳞癌临床病理参数的相关性及对OSCC病人生存的影响。免疫组化检测84例口腔鳞癌患者标本中p-AKT与LC3B的蛋白表达水平，并分别统计p-AKT与LC3B蛋白表达水平与CASC9表达的相关性。用siRNA沉默CASC9在OSCC细胞中表达后，分别用MTT实验检测细胞活性、流式细胞术和Tunel实验检测细胞凋亡、电镜下观察自噬，western blotting检测AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、P62、BCL2、BAX蛋白表达。在CASC9沉默的OSCC细胞中分别加入AKT激活剂和自噬抑制剂进行回复实验。用shRNA干扰后的OSCC细胞进行体内成瘤实验，检测体内成瘤的肿瘤重量、体积和生长速度，检测肿瘤中LC3B、P62、BCL2、BAX mRNA的表达水平。　　结果：口腔鳞癌组织和口腔鳞癌细胞中的CASC9表达水平分别较癌旁组织和正常口腔黏膜细胞显著升高(p＜0.05)。高表达的CASC9与OSCC患者的肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移和生存时间显著相关(p＜0.05)。在口腔鳞癌细胞SCC15和CAL27中, 沉默CASC9后导致细胞的自噬和凋亡显著增加，增殖显著降低(p＜0.05) ，同时 p-AKT, p-mTOR, P62和BCL-2的表达水平显著降低(p＜0.05)，BAX和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值显著升高(p＜0.05)。在沉默CASC9的SCC15和CAL27中分别加入AKT激活剂SC79和自噬激活剂Autophinib后发现：加入SC79后细胞的自噬和凋亡显著回复降低，加入Autophinib后细胞的凋亡显著回复降低(p＜0.05)。此外，体内裸鼠成瘤实验证明沉默CASC9可抑制OSCC肿瘤形成。　　结论：高表达的长链非编码RNA CASC9通过激活AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬及自噬介导的凋亡从而促进OSCC发生发展。CASC9可能成为口腔鳞癌诊断的潜在生物标记物和治疗靶点。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1 实验材料和方法

1.1 细胞培养

1.1.1 实验材料

1.1.2 实验方法

1.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

1.2.1 实验材料

1.2.2 实验方法

1.2.3 结果分析

1.3 蛋白免疫印记技术（Western Blotting）

1.3.1 实验材料

1.3.2 实验方法

1.3.3 结果分析

1.4 原位杂交实验（In situ hybridization）

1.4.1 实验材料

1.4.2 实验方法

1.4.3 结果分析

1.5 免疫组化实验（Immunohistochemistry）

1.5.1 实验材料

1.5.2 实验方法

1.5.3 结果分析

1.6 免疫荧光实验（Immunofuorescence assay）

1.6.1 实验材料

1.6.2 实验方法

1.6.3 结果分析

1.7 电镜实验（Transmission electron microscopy）

1.7.1 实验材料

1.7.2 实验方法

1.7.3 结果分析

1.8 流式细胞术（Flow cytometry assay）

1.8.1 实验材料

1.8.2 实验方法

1.8.3 结果分析

1.9 Tunel 实验（TUNEL assay）

1.9.1 实验材料

1.9.2 实验方法

1.9.3 结果分析

1.10 MTT实验（MTT assay）

1.10.1 实验材料

1.10.2 实验方法

1.10.3 结果分析

1.11 体内成瘤实验（In vivo tumorigenicity assay）

1.11.1 实验材料

1.11.2 实验方法

1.11.3 结果分析

1.12 数据统计

2 实验结果

2.1 CASC9在口腔鳞癌组织和细胞中表达升高

2.2 表达升高的CASC9与口腔鳞癌患者的预后相关。

2.3 降低CASC9表达抑制肿瘤细胞增殖促进凋亡

2.4 降低CASC9表达促进细胞自噬

2.5 降低CASC9表达抑制AKT/mTOR通路活性。

2.6 CASC9通过AKT/mTOR通路抑制细胞凋亡和自噬。

2.7 CASC9通过抑制细胞自噬促进凋亡

2.8 降低CASC9表达抑制体内成瘤

3 讨论

全文总结

参考文献

附图

文献综述:lncRNA作用机制的研究现状

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文