RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制与表达及其机制研究

摘要

目的：观察RNA干扰技术在抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制与表达方面的作用，同时，对Dicer基因在RNA干扰产生机制中的作用进行探讨。 方法：(1)将13倍HBV基因克隆入pCDNA3．1中，构建HBV真核表达载体pHBV，将其转染肝癌细胞HepG2，建立HBV瞬时表达模型，并通过ELISA、免疫荧光、Southern和Northernblot检测对该模型进行评价；(2)针对乙型肝炎病毒的四个开发放性读码框，设计并构建十种shRNA表达载体pShRNA；将pHBV和pShRNA共转染入肝癌细胞，通过ELISA、免疫荧光、Southern、Northern、Westernblot和RT-PCR检测，观察HBV复制与表达受抑制的情况。(3)设计并构建两种针对Dicer基因中RNA酶III结构域的shRNA表达载体，即pShRNA-D1和pShRNA-D2，先将其转染HepG22．2．15细胞和结肠癌细胞，通过RT-PCR检测，观察Dicer基因受抑的情况。将pShRNA-Dl转染整合了绿色荧光蛋白(GFP)基因的HepG2A9细胞，以抑制其Dicer基因的表达，再转染抗GFP的shRNA表达载体，观察Dicer受抑制后，是否影响后续shRNA表达载体的功能发挥，以此反映Dicer酶在RNA干扰产生机制中的作用。 结果：(1)成功构建了HBV真核表达载体pHBV，通过ELISA、免疫荧光、Southem和Northemblot能检测到HBV的复制与表达，说明通过转染pHBV可以建立HBV瞬时感染模型。(2)成功构建了十种针对HBV的shRNA表达载体，通过ELISA、免疫荧光、Southern、Northern、Westemblot及RT-PCR等，观察到HBV复制与表达均受到明显抑制，说明RNA干扰可以有效抑制HBV的复制与表达。(3)成功构建了两种针对Dicer基因中RNA酶III结构域的shRNA表达载体，通过RT-PCR检测发现，在三个细胞系中，Dicer基因的表达均受到明显抑制，说明通过载体表达shRNA的方式可以抑制Dicer基因的表达。当细胞Dicer水平降低时，后续抗GFP的shRNA表达载体不能发挥其功能，说明shRNA表达载体功能的发挥必需依赖于Dicer基因的存在。 结论：RNA干扰可以有效抑制HBV的复制与表达；Dicer基因在RNA产生机制中起重要作用。

目录

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摘要

前言

第一部分乙型肝炎病毒瞬时表达模型的建立与评价

第二部分RNA干扰抑制乙肝病毒的复制与表达

第三部分RNA干扰抑制Dicer基因表达及其对干扰作用的影响

全文总结

文献综述

致谢

攻读学位期间发表论文、发明专利申请、参加学术会议情况