人骨髓和胎盘基蜕膜间充质干细胞在低氧无血清的SIS上生物学特性的对比

摘要

目的：在小肠粘膜下层（small intestinal submucosa, SIS）三维培养体系中，比较人骨髓和胎盘基蜕膜来源间充质干细胞（ mesenchymal stem cells，MSCs）在低氧无血清的培养条件下细胞的生物学特性，为筛选更优越的组织工程种子细胞提供实验依据。方法：无菌条件下分离提取人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,）以及人胎盘基蜕膜间充质干细胞（pacental decidua basalis-mesenchymal stem cells, PDB-MSCs）并进行体外扩增培养，并检测人 BM-MSCs和 PDB-MSCs表面标记物（CD34、CD11b、CD19、CD90、CD44和 CD105）的表达情况。同时在成脂、成骨和成软骨诱导培养环境下进行诱导分化来鉴定 BM-MSCs和PDB-MSCs的多向分化潜能。以鉴定BM-MSCs和PDB-MSCs的多向分化潜能。然后取PDB-MSCs和BM-MSCs接种于SIS上，共培养7天后在扫瞄电镜下（scanning electron microscope， SEM）下观察MSCs在SIS上的形态特征，然后将其随机分为4组：分别是 BM-MSCs常氧有血清组（ normoxia and complete medium， N/CM）、 BM-MSCs低氧无血清组（ hypoxia and serum deprivation, H/SD）、PDB-MSCs常氧有血清组（normoxia and complete medium，N/CM）和 PDB-MSCs低氧无血清组（hypoxia and serum deprivation, H/SD）。其中常氧条件下，体外三气培养箱氧含量为21％，低氧条件下，氧含量为1%；有血清条件下含FBS10%，无血清条件下，含FBS0%。采用CCK8的检测方法分别检测PDB-MSCs和BM-MSCs复合物分别在低氧无血清、常氧有血清条件下培养0h，6h，12h，24h后的增殖情况；并采用凋亡流式细胞盒（ Annexin V/propidium iodide，AV/PI）检测观察BM-MSCs和PDB-MSCs复合物分别在低氧无血清、常氧有血清条件下培养6h，48h，72h后的凋亡情况；并采用 Q-PCR检测BM-MSCs和PDB-MSCs复合物在低氧无血清、常氧有血清中处理72h后的血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） mRNA的表达情况；Western Blot检测两种细胞在低氧无血清条件下72h抗凋亡相关蛋白 AKT、ERK1/2、Bcl2蛋白表达情况。结果：本实验中PDB-MSCs和BM-MSCs均成功于骨髓和胎盘组织中提取并进行了体外扩增，光学显微镜下P3代以后，两种MSCs形态均为长梭形的成纤维样细胞，并呈“鱼群样”紧密排列。通过流式鉴定提示两种细胞均表达了抗原CD73、CD90以及CD105，均不表达表面抗原CD34、CD11b和CD19。此外，两种细胞均可向成骨、成脂和成软骨分化，具有多向分化性能。SEM扫描电镜下观察在SIS小肠黏膜下层上BM-MSCs和PDB-MSCs与SIS具有良好的生物相容性，在SIS均表现为长梭形，并分泌大量基质附于支架三维结构上。CCK8检测提示24h内在低氧无血清条件可促进 BM-MSCs以及PDB-MSCs增值（P<0.05）且 PDM-MSCs耐受低氧能力更强（P<0.05）。AV/PI检测提示在低氧无血清处理的48小时内，PDB-MSCs以及BM-MSCs均能够耐受凋亡（P＞0.05），差异无统计学意义。在低氧无血清处理72h, PDB-MScs凋亡率较BM-MSCs在低氧无血清条件下更低（P<0.05）,提示PDB-MSCs与BM-MSCs相比，表现出更好的耐受凋亡。Q-PCR检测两种细胞中在低氧无血清条件下 VEGF表达量，提示 PDB-MSCs表达量高于BM-MSCs。Western Blot检测显示低氧无血清条件下PDB-MSCs表达抗凋亡蛋白ERK1/2、AKT、BCL2含量明显高于BM-MSCs（P<0.05）。结论：BM-MSCs和PDB-MSCs在SIS生长状态良好，在低氧无血清条件下，与BM-MSCs相比， PDB-MSCs表现出更好的耐受低氧无血清的特性，故人PDB-MSCs是一种优良的组织工程种子细胞。

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封面

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

5 统计学分析

结果

1 BM-MSCs和PDB-MSCs的生长形态变化

2 PDB-MSCs和BM-MSCs的鉴定结果

3 PDB-MSCs和BM-MSCs在低氧无血清模型中的增殖情况

4 PDB-MSCs和BM-MSCs在低氧无血清模型中凋亡比率

5 QT-PCR检测两种MSCs在低氧无血清模型中VEGF的表达量

6 BM-MSCs和PDB-MSCs中低氧无血清模型中AKT、ERK1/2、BCL2的表达量

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:低氧条件下骨髓与胎盘来源间充质干细胞生物学特性比较

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