骨髓和胎盘基蜕膜来源间充质干细胞在小肠黏膜下层三维培养体系中成心肌样细胞分化能力比较

摘要

目的:比较骨髓和胎盘基蜕膜来源间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)在小肠粘膜下层(small intestinal submucosa，SIS)三维培养体系中的成心肌样细胞分化能力，为心肌组织工程种子细胞的筛选提供理论依据。　　方法:分别从人骨髓和胎盘基蜕膜组织中分离提取间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)进行体外扩增培养。采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)和胎盘基蜕膜间充质干细胞(pacental deciduabasalis-mesenchymal stem cells， PDB-MSCs)中细胞表面标志物的表达。采用成骨、成脂和成软骨诱导分化的方法鉴定BM-MSCs和PDB-MSCs的多向分化潜能。将BM-MSCs和PDB-MSCs分别在SIS上复合培养5d，待形成细胞支架复合物后将复合物随机分为4组，分别是BM-MSCs-SIS诱导组、BM-MSCs-SIS非诱导组、PDB-MSCs-SIS诱导组和PDB-MSCs-SIS非诱导组。其中所有诱导组中的复合物在使用成心肌样细胞分化诱导剂5-氮胞苷（5-azacytidine，5-aza）作用24h后更改为普通完全培养基继续培养4w。非诱导组中复合物不添加5-aza，而是用等量的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替，其它操作同诱导组。4w后，扫描电镜(scanning electron microscope， SEM)观察BM-MSCs和PDB-MSCs在SIS中的形态变化;抗人cTnⅠ的免疫荧光染色显示两种细胞的成心肌样细胞分化现象;流式细胞仪计数两种细胞的分化率;RT-PCR检测成心肌样细胞分化诱导过后的两种细胞中心脏发育早期转录因子Nkx2.5和GATA-4的表达情况;Western Blot检测心肌细胞分化中晚期特异性蛋白cTnⅠ和CX43的表达情况;倒置显微镜观察SIS边缘区域的两种细胞是否有细胞搏动现象。　　结果:本实验过程中从人骨髓和胎盘基蜕膜组织提取的MSCs均表达CD90、CD44、CD73和CD105，均不表达CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR，均表现出了成骨、成脂和成软骨的多向分化潜能。BM-MSCs和PDB-MSCs在SIS中分别用5-aza进行成心肌分化诱导培养4w后的SEM检测结果显示BM-MSCs和PDB-MSCs均与SIS具有良好的生物相容性，诱导后的部分细胞出现了类似心肌细胞的星形或长杆状外形改变。免疫荧光染色显示BM-MSCs和PDB-MSCs都产生了成心肌样细胞分化，然而流式细胞仪检测结果提示两种细胞的分化率没有明显差异。分化诱导后的两种细胞都表达心脏发育早期转录因子Nkx2.5和GATA-4，心肌细胞分化中晚期特异性蛋白cTnⅠ和CX43。分化诱导过后两种细胞之间的心脏发育早期转录因子Nkx2.5和GATA-4的表达量没有显著差异（P＞0.05）。然而，心肌细胞分化中晚期特异性蛋白cTnⅠ和CX43在分化诱导后的PDB-MSCs中的表达量明显高于其在分化诱导后的BM-MSCs中的表达量（P＜0.05）。同时，在倒置显微镜下并没有观察到SIS边缘区域的BM-MSCs和PDB-MSCs在被诱导成为心肌样细胞以后具有细胞搏动现象。　　结论: SIS是一种良好的心肌组织工程支架材料，它与BM-MSCs和PDB-MSCs之间具有良好的生物相容性。尽管BM-MSCs和PDB-MSCs在SIS三维环境中经5-aza诱导分化而成的心肌样细胞都不是完全成熟的心肌细胞，但是与BM-MSCs相比，由PDB-MSCs诱导分化而成的心肌样细胞的分化成熟度更高，因而PDB-MSCs可能更加适合被作为心肌组织工程的种子细胞。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

5 统计学分析

结果

1 BM-MSCs和PDB-MSCs的形态变化

2 BM-MSCs和PDB-MSCs的鉴定结果

3 BM-MSCs和PDB-MSCs的免疫荧光和分化率检测结果

4 BM-MSCs和PDB-MSCs中基因和蛋白表达

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述 低氧条件下骨髓与胎盘来源间充质干细胞生物学特性比较

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