细胞色素P4501A1在白藜芦醇抑制人肝癌细胞增殖及促进其凋亡中的作用

摘要

目的:原发性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，恶性程度较高，病灶容易转移，治疗效果差。白藜芦醇（Resveratrol）是从虎杖、葡萄等植物中提取的一种多酚类物质，近年来研究显示，白藜芦醇具有抗肿瘤、保护血管神经、抗炎、影响骨钙水平等作用，是治疗脂类代谢紊乱、炎症和心脏疾病的有效成分。据文献报道，白藜芦醇具有抗肝癌的作用，但抗肝癌作用具体机制尚不清楚。诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖是研究抗肿瘤药物的常规途径，本研究拟从体外角度，研究白藜芦醇对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及凋亡的影响，并初步探讨其可能的作用机制。通过CCK-8法检测白藜芦醇影响人肝癌细胞SMMC-7721增殖的时效及量效关系，以确定白藜芦醇发挥最大作用的浓度及时间范围。应用Hoechst-33258染色及双染流式细胞术(AnnexinⅤ/P)检测凋亡细胞形态学及量的变化，Realtime-PCR技术检测白藜芦醇干预前后人肝癌细胞SMMC-7721表达细胞色素P4501A1mRNA(CYP1A1)的变化。蛋白印记分析(Westernblotanalysis)法检测白藜芦醇干预前后人肝癌细胞SMMC-7721表达细胞色素P4501A1蛋白的变化。　　方法:分别用浓度25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的白藜芦醇作用人肝癌细胞24h、48h、72h，CCK-8法检测白藜芦醇对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用。分别以无处理的人肝癌细胞SMMC-7721及相同剂量的DMSO为空白和随机对照组，AnnexinⅤ/PI流式细胞术观察100μmol/L的白藜芦醇作用72h后对人肝癌细胞SMMC-7721凋亡率的影响，Hoechst-33258观察100μmol/L白藜芦醇作用72h后人肝癌细胞SMMC-7721中凋亡细胞形态学的变化。Real-timePCR分析100μmol/L的白藜芦醇作用前后对人肝癌细胞SMMC-7721表达CYP1A1mRNA的影响。蛋白印记分析（Westernblotanalysis）法检测100μmol/L的白藜芦醇作用前后人肝癌细胞SMMC-7721中CYP1A1蛋白表达情况。　　结果:CCK-8检测结果显示，在体外培养状态下，白藜芦醇能显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖，在本实验的浓度剂量范围内，随着白藜芦醇浓度的不断增大，抑制增殖的效果明显增强，呈浓度依赖关系。同一浓度随着作用时间的不断延长，抑制增殖的效果明显增强，呈时间依赖性。不同浓度白藜芦醇（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μμmol/L）作用人肝癌细胞24h后增殖抑制率分别为（8.38±1.75％、15.40±3.32％、22.35±2.43％、15.57±1.73％），不同浓度白藜芦醇（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）作用人肝癌细胞48h后增殖抑制率分别为(12.60±1.51％、20.70±3.21％、40.60±2.33％、51.67±3.70％)，不同浓度白藜芦醇（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）作用人肝癌细胞72h后增殖抑制率分别为（15.42±3.54％、24.57±3.81％、60.51±3.50％、65.51±2.41％），经统计分析得出，不同浓度白藜芦醇对人肝癌细胞SMMC-7721增殖抑制率不同(F=14.03，P=0.03)，相同浓度白藜芦醇在不同作用时间对人肝癌细胞SMMC-7721增殖抑制率也有明显差异(F=15.04，P＜0.05)，所以一定浓度白藜芦醇作用一定时间范围内，其对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用存在浓度及时间依赖性。从人肝癌细胞SMMC-7721在白藜芦醇作用下的量效曲线上可以看出:100μmol/L白藜芦醇作用72h后随药物浓度的升高抑制率斜率开始下降，说明单位时间内抑制效率开始下降，因此认为100μmol/L白藜芦醇作用72h对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用最为明显。后续实验以此作为作用截止点。Hoechst-33258染色结果显示:100μmol/L的白藜芦醇作用72h后人肝癌细胞SMMC-7721细胞核呈现明显凋亡形态，随机对照组及空白组人肝癌细胞SMMC-7721细胞核无明显变化。双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示:空白对照组、随机对照组、100μmol/L白藜芦醇实验组的凋亡率分别为10.27％、12.31％、38.54％。RT-PCR结果:100μmol/L白藜芦醇作用72h后细胞CYP1A1mRNA的表达出现显著下降。进一步检测发现CYP1A1蛋白的表达也呈现下降趋势。　　结论:体外培养状态下，白藜芦醇能抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖、促进其凋亡，其机制可能与白藜芦醇在转录水平下调CYP1A1mRNA的表达、从而在翻译水平减少CYP1A1的蛋白表达有关。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验细胞

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4．实验方法

结果

1．CCK-8检测不同浓度白藜芦醇对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制作用

2．白藜芦醇对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

3．白藜芦醇对人肝癌细胞SMMC-7721凋亡率的影响

4．琼脂糖凝胶电泳判断人肝癌细胞SMMC-7721总RNA完整性

5．白藜芦醇对人肝癌SMMC-7721表达CYP1A1的影响

6．Westem blot法检测经白藜芦醇干预后人肝癌细胞SMMC-7721表达CYP1A1蛋白的变化

讨论

结论

参考文献

缩略词表

致谢

综述 白藜芦醇抗肝癌作用机制研究进展

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