P364L突变对UGT1A1酶催化非结合胆红素葡糖醛酸化的影响

摘要

以非结合胆红素升高为主的先天性高胆红素血症在临床中并不罕见，其中最常见的为1901年Gilbert和Lereboullet发现的Gilbert综合症，其次为Arias在1962年发现的Crigler-Najjar综合症Ⅱ型(CNS-Ⅱ)，最少见也最为致命的是1952年被Crigler和Najjar报道的Crigler-Najjar综合症Ⅰ型(CNS-Ⅰ)。GS、CNS-Ⅰ和CNS-Ⅱ发病机制相同，均为编码尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase1A1，UGT1A1)的基因发生突变，使突变的UGT1A1酶催化非结合胆红素的活性下降。　　目前已发现了130个UGT1A1基因上的突变位点，这些突变点大多位于外显子1、2、5上，而外显子3、4上的突变相对较少[1]。课题组前期研究发现了1例CNS-Ⅱ患者携带有外显子上的纯合突变c.1091C＞T。该突变点位于UGT1A1基因外显子4上，使UGT1A1酶的第364个氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸(P364L)。　　以往的研究中关于P364L突变的报道较少，在非亚洲人群中至今还没有该突变位点的报道，而课题组发现的CNS-Ⅱ患者携带P364L纯合突变，是目前为止报道的第1例。为明确P364L突变酶对非结合胆红素催化能力的影响我们构建变异体进行实验。　　目的:UGT1A1基因外显子4上的突变c.1091C＞T，导致UGT1A1酶的第364个氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，本实验旨在验证P364L突变酶催化非结合胆红素葡糖醛酸化能力的下降。　　方法:以携带正常UGT1A1基因的野生型质粒为模板，用核苷酸引物介导的定点突变法构建携带c.1091C＞T基因的突变型质粒。突变型质粒测序并将测序结果与野生型质粒比对，验证突变型质粒是否构建准确。用突变型质粒和野生型质粒分别转染HEK293细胞，表达P364L突变酶和UGT1A1野生酶。提取用野生型质粒和突变型质粒分别转染HEK293细胞后表达的总RNA，逆转录合成cDNA。实时荧光定量方法分别检测野生型质粒和突变型质粒表达的差异。超声破碎仪裂解HEK293细胞，低温高速离心后留取上清。Western blot验证UGT1A1野生酶及P364L突变酶的表达。绘制非结合胆红素标准曲线，用UGT1A1野生酶和P364L突变酶分别催化非结合胆红素与尿苷二磷酸葡糖醛酸(Uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA)的结合反应，高效液相色谱仪（High performance liquid chromatograph，HPLC）定量分析非结合胆红素浓度的变化，比较UGT1A1野生酶和P364L突变酶对非结合胆红素葡糖醛酸化的催化活性。　　结果:1.测序结果显示野生型质粒UGT1A1基因的第4个外显子上的第1091个碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，对应到互补链为胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，突变质粒构建成功。　　2.Western blot检测HEK293细胞转染UGT1A1野生型和P364L突变型质粒后的蛋白表达，PVDF膜扫描显示55KD左右处可见UGT1A1蛋白表达。　　3.提取野生型、突变型质粒分别转染HEK293细胞后表达的总RNA，实时荧光定量PCR结果显示野生型质粒和突变型质粒表达无差异。　　4.绘制非结合胆红素标准曲线，得到方程式:y=0.0571x+0.1011，R2=0.9946（其中X为非结合胆红素峰面积，Y为非结合胆红素浓度μg/mL），非结合胆红素浓度在0.31255μg/mL～5μg/mL时与非结合胆红素峰面积有良好的线性关系。　　5.用分别转染P364L突变质粒和UGT1A1野生质粒后的HEK293细胞均浆催化非结合胆红素与UDPGA的酯化反应，UGT1A1野生酶和P364L突变酶反应组在15min内非结合胆红素浓度下降幅度最大，总体来讲P364L突变酶催化组非结合胆红素的浓度下降低于UGT1A1野生酶催化组。　　结论:UGT1A1基因外显子4上的突变c.1091C＞T使其翻译合成的P364L突变酶催化非结合胆红素能力低于UGT1A1野生酶。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 UGT1A1突变质粒的构建及基因表达的验证

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第三章 P364L酶催化非结合胆红素葡糖醛酸化反应

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 先天性高胆红素血症及UGT1A1酶活性研究进展

攻读硕士期间发表的论文

致谢