α-淀粉酶AmyP融合三个外源淀粉结合结构(SBD)后的酶学性质研究

摘要

α-淀粉酶(α-amylase)是一个重要的工业用酶，广泛应用在食品、化工、酿造等行业。具有生淀粉降解能力的α-淀粉酶AmyP来自海洋宏基因文库，它不仅能快速的降解多种生淀粉，而且对生大米淀粉具有偏好性。AmyP有一个淀粉结合结构域SBD，该SBD的缺失不会急剧降低AmyP的生淀粉降解能力。为了提高AmyP的降解能力，我们对AmyP的SBD进行了替换，选择来自Cryptococcus sp.S-2，Thermobifida fuscaNTU22和Clostridium butyricum T-7的α-淀粉酶的SBD与AmyP△SBD（缺失SBD）进行融合，在大肠杆菌中重组表达，获得三个融合酶AmyP-Cr、AmyP-Th和AmyP-Cl。
　　融合酶AmyP-Cr是AmyP△SBD与Cryptococcus sp.S-2的α-淀粉酶的SBD的融合，在三个融合酶中酶学性质最好。AmyP-Cr对生大米淀粉的比活达到327.9±31.8U/mg，是野生型AmyP的1.7倍。4h内，AmyP-Cr对大米生淀粉的最高降解率为46.6％，是野生型AmyP的1.8倍。AmyP-Cr的对生大米淀粉的最高结合率为0.113uM/g，是同条件下AmyP的5.1倍。而且AmyP-Cr的热稳定性也获得了提高，40℃的半衰期超过12h，是野生型AmyP的5.1倍。这些数据表明融合酶AmyP-Cr对生大米淀粉降解能力的提高，是由于来自Cryptococcus sp.S-2的SBD能同时提高酶对生大米底物的吸附力和热稳定性。AmyP-Cr是一个新的性质比较优良的生大米淀粉降解酶。
　　融合酶AmyP-Th是AmyP△SBD与Thermobifida fusca NTU22的α-淀粉酶的SBD融合。AmyP-Th对生大米淀粉的比活为254.2±26.5U/mg，为野生型AmyP的1.3倍。4h内，AmyP-Th对大米生淀粉的最高降解率为39.6％，虽然比野生型AmyP的提高了1.5倍，但是略低于AmyP-Cr的降解率。AmyP-Th的热稳定性没有明显改善。
　　融合酶AmyP-Cl是AmyP△SBD与Clostridium butyricum T-7的α-淀粉酶的SBD融合。AmyP-Cl对生大米淀粉的比活为468.6±43.5U/mg，为野生型AmyP的2.4倍。虽然AmyP-Cl的比活在三个融合蛋白中最高，但是AmyP-Cl在4h内对大米生淀粉的最高降解率为41.6％，略低于AmyP-Cr。此外，AmyP-Cl的热稳定性也没有明显改善。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 淀粉酶与生淀粉

1．1．1 生淀粉

1．1．2 淀粉酶

1．1．3 生淀粉酶

1．2 生淀粉酶AmyP

1．2．1 AmyP的来源及特点

1．2．2 AmyP的序列分析

1．3 淀粉结合结构域(SBD)

1．3．1 定义

1．3．2 分类及功能

1．4 融合蛋白

1．5 研究目的、内容及意义

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究意义

1．5．3 研究内容

第二章 AmyP与来自菌株Cryptococcus sp．S-2的SBD的融合研究

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 酶和主要试剂及实验仪器设备

2．1．3 试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 重组质粒pET28a-AmyP-Cr的构建

2．2．2 融合酶的诱导表达及纯化

2．2．3 融合酶AmyP-Cr最适反应条件的测定

2．2．4 动力学参数的测定

2．2．5 酶对生大米淀粉的降解率

2．2．6 酶对大米生淀粉的吸附作用

2．2．7 扫描电镜观察彻底降解后生淀粉颗粒表面的结构变化

2．3 融合酶AmyP-Cr的结果与分析

2．3．1 Cr-SBD的序列分析

2．3．2 重组质粒pET28a-AmyP-Cr的构建

2．3．3 pET28a-AmyP-Cr的诱导表达与纯化

2．3．4 融合酶AmP-Cr的最适反应条件

2．3．5 AmyP-Cr的底物特异性

2．3．6 AmyP-Cr对生大米淀粉水解动力学

2．3．7 AmyP-Cr的吸附作用

2．3．8 AmyP-Cr对生大米淀粉的降解率

2．3．9 AmyP-Cr热稳定性

2．3．10 AmyP-Cr的电镜扫描

2．4 本章小结

第三章 AmyP与来自菌株Thermobifida fusca NTU22的SBD融合的研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 重组质粒pET28a-AmyP-Th的构建

3．2．2 AmyP-Th诱导表达及酶学性质的测定

3．3 实验结果分析

3．3．1 Th-SBD的序列分析

3．3．2 重组质粒pET28a-AmyP-Th的构建

3．3．3 AmyP-Th诱导表达和纯化

3．3．4 AmyP-Th最适反应条件的测定

3．3．5 AmyP-Th最适底物

3．3．6 AmyP-Th的酶促反应动力学

3．3．7 AmyP-Th对生大米淀粉的降解率

3．3．8 AmyP-Th的温度稳定性

3．4 本章小结

第四章 AmyP与来自菌株Clostridium butyricum T-7的SBD的融合研究

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 重组质粒pET28a-AmyP-Cl的构建

4．2．2 融合酶AmyP-Cl的诱导表达纯化及酶学性质的测定

4．3 实验结果分析

4．3．1 Cl-SBD的序列分析

4．3．2 重组质粒pET28a-AmyP-Cl的构建

4．3．3 融合酶AmyP-Cl诱导表达和纯化

4．3．4 AmyP-Cl的最适反应条件的测定

4．3．5 AmyP-Cl的底物特异性

4．3．6 AmyP-Cl酶促反应动力学

4．3．7 AmyP-Cl对生大米淀粉的降解率

4．3．8 AmyP-Cl的温度稳定性

4．4 本章小结

主要结论与创新点

参考文献

附录

致谢

研究生期间发表论文情况