低分子量PEI接枝大豆蛋白基因载体的构建及转染性能研究

摘要

基因缺失和异常常导致许多疾病的发生，包括癌症，心血管疾病，遗传病等，这些疾病严重危害着人类的生命健康。基因治疗作为一种新型的生物治疗手段，因其能够安全、准确、有效的修正异变基因而备受关注。然而，如何设计适合的载体将目的基因高效、准确地运载到靶细胞中仍然是目前研究的重点与难点。聚乙烯亚胺(PEI)是普遍应用的阳离子聚合物基因载体之一，因其质子化之后具有高的电荷密度和良好的质子缓冲能力。其中，高枝化度后的PEI25 KDa和22 KDa拥有高的转染效率，因而被称作聚阳离子基因载体领域中的“黄金准则”。但是高分子量PEI细胞毒性大，生物降解能力差，易与血清蛋白结合等严重制约了其作为基因载体的应用。另一方面，低分子量的PEI尽管细胞毒性弱，但是转染效率低，有些甚至几乎没有转染效率。为了解决低分子量PEI转染效率低的问题，近年来研究人员对低分子量PEI进行了多方面的研究。
　　本论文基于天然大分子大豆分离蛋白为起始原料制备出一类简单、可生物降解、高效的的聚阳离子基因载体。首先对大豆分离蛋白进行酶解，接着离心和透析纯化，得到具有良好水溶性的低分子量大豆蛋白(SP)。将不同低分子量的PEI(600Da，1200Da，1800Da)通过酰胺化反应修饰在大豆蛋白上得到一系列大豆蛋白-PEI复合产物(SP-PEIs)，分别命名为SP-PEI600，SP-PEI1200，SP-PEI1800。经过红外和Zeta电位等实验证实，不同低分子量PEI成功地接枝到大豆蛋白上。通过酸碱滴定实验证明聚合物SP-PEIs的质子缓冲能力，通过蛋白吸附实验检测聚合物SP-PEIs对血清蛋白的抑制作用。接下来，复合物SP-PEIs/DNA的理化性质得到进一步详细研究。
　　聚合物与DNA形成的复合物具有理想的粒径和电位有利于其快速进入细胞和提高基因转染。在pH为7.4的生理条件下，SP-PEIs与DNA形成的复合物随着N/P质量比的增加，复合物的粒径逐渐发生改变，最终会稳定在100-200nm左右，复合物SP-PEIs/DNA的电位也是随着N/P质量比的增大而增长。检测不同pH下复合物SP-PEIs/DNA粒径的变化，发现其在生理条件下(pH=7.4)可以稳定存在，在酸性条件下粒径发生明显变化，该特性有助于复合物上中的DNA从内涵体中逃逸出来。另外，通过琼脂糖电泳实验检测聚合物SP-PEIs对DNA的压缩能力，DNaseⅠ降解实验和肝素置换实验则进一步检测聚合物对DNA的压缩能力。
　　之后，通过一系列细胞实验进一步评估了聚合物SP-PEIs作为基因载体的潜力和优势。枝化的PEI25KDa作为对照组，体外细胞毒性实验表明，在人肾上皮细胞(293T)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)共培养中，聚合物SP-PEIs均表现出比对照组PEI25 KDa更低的毒性及良好的生物相容性。利用流式细胞仪和荧光倒置显微镜检测SP-PEIs/DNA复合物在有血清和无血清环境下的转染效率。结果证明，无论在有血清和无血清条件下复合物SP-PEIs/DNA在SH-SY5Y细胞系均有较高的转染效率。特别是聚合物SP-PEI1800与DNA在质量比为24时，无血清条件下转染效率(5.27％)是对照组(1.94％)的2.7倍，在有血清条件下则高达3.4倍;而在293T细胞中，无血清条件下聚合物SP-PEI1800与质粒DNA质量比为24的时候最高转染效率(15.1％)和对照组的转染效率(16.6％)几乎相当;同样的在有血清状态下，聚合物SP-PEI1800(8.19％)也能取得和对照组类似的转染效率(7.22％)。
　　本论文制备的复合物SP-PEIs作为新型的基因载体，具有较低的细胞毒性，良好的生物相容性，同时能够降低血清蛋白的吸附，提高DNA在细胞中的的稳定性，并促进基因转染效率的提升。因此，在基因治疗的应用中，聚合物SP-PEIs作为基因载体拥有巨大的潜在应用价值。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1 基因治疗概述

1．2 聚阳离子非病毒载体

1．2．1 常见的阳离子聚合物基因载体

1．3 聚乙烯亚胺

1．3．1 高分子量PEI的改性研究

1．3．2 低分子量PEI的改性与研究

1．4 聚阳离子作为基因载体的障碍

1．4．1 细胞摄取途径

1．4．2 内涵体逃逸

1．4．3 目的基因的表达

1．5 选题思路、研究内容

第二章 酶解大豆分离蛋白

2．1 引言

2．2 实验试剂和仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 酶解大豆分离蛋白最优条件的探究

2．3．2 酶解后大豆蛋白的制备

2．3．3 SDS-PAGE分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 预处理时间测定

2．4．2 大豆分离蛋白浓度测定

2．4．3 酶浓度测定

2．4．4 酶解时间测定

2．4．5 酶解最优条件测定

2．4．6 大豆蛋白的纯化和分子量的测定

2．5 本章小结

第三章 聚合物SP-PEIs的制备及表征

3．1 引言

3．2 实验试剂和仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 聚合物SP-PEIs的制备

3．4 表征方法

3．4．1 聚合物SP-PEIs结构的表征

3．4．2 聚合物SP-PEIs的电位实验

3．4．3 聚合物SP-PEIs接枝效率的测定

3．4．4 聚合物SP-PEIs伯胺含量的测定

3．4．5 聚合物SP-PEIs酸碱滴定实验

3．4．6 聚合物SP-PEIs的蛋白吸附实验

3．5 结果与讨论

3．5．1 聚合物SP-PEIs的FT-IR分析

3．5．2 聚合物SP-PEIs的电位检测

3．5．3 聚合物SP-PEIs接枝效率的测定

3．5．4 聚合物SP-PEIs质子缓冲能力的测定

3．5．5 聚合物SP-PEIs蛋白吸附能力的测定

3．6 本章小结

第四章 复合物SP-PEIs／DNA的制备及表征

4．1 引言

4．2 实验试剂和仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 无内毒素质粒提取与纯化

4．3．2 无内毒素质粒的纯度及浓度测定

4．3．3 复合物SP-PEIs／DNA的制备

4．3．4 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验

4．3．5 肝素置换实验

4．3．6 DNase Ⅰ酶降解实验

4．3．7 复合物SP-PEIs／DNA的粒径以及Zeta电位测定

4．3．8 不同pH中复合物SP-PEIs／DNA的稳定性

4．4 结果与讨论

4．4．1 凝胶电泳阻滞实验

4．4．2 肝素置换实验

4．4．3 DNase Ⅰ酶降解实验

4．4．4 复合物SP-PEIs／DNA的粒径和Zeta电位

4．4．5 不同pH中复合物SP-PEIs／DNA的稳定性

4．5 本章小结

第五章 聚合物SP-PEIs的细胞毒性评价及其介导的体外基因转染研究

5．1 引言

5．2 实验试剂和仪器

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验仪器

5．3 实验方法

5．3．1 细胞培养

5．3．2 细胞毒性实验

5．3．3 聚合物SP-PEIs介导293T和SH-SY5Y细胞的体外转染实验

5．4 结果与讨论

5．4．1 聚合物SP-PEIs的细胞毒性

5．4．2 聚合物SP-PEIs介导293T和SH-SY5Y细胞的基因转染

5．5 本章小结

结论

参考文献

致谢

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