有机汞裂解酶MerB转化有机汞和调控蛋白MerR的结构与功能研究

摘要

近些年随着重金属汞的广泛运用，含汞废物排放已构成环境污染，严重破坏了生态系统并威胁着人类健康。环境中的汞污染尤其是有机汞化合物污染影响巨大且引发严重疾病，如易危害神经系统的甲基汞有极强毒性被认为是水俣病的主要致病物。汞在自然界中容易经食物链造成生物富集而难以排出体内形成潜在威胁。因此，监测及去除汞污染是控制汞中毒的重要目标并逐渐被深入研究，而具备经济高效的生物修复有望成为治理汞污染的重要措施。
　　一种抗汞微生物经本实验室分离筛选而得，并鉴定该菌属Bacillus，含有完整的抗汞基因簇，命名为Hg401菌。检测Hg401菌的抗汞能力，发现该菌对有机汞及无机汞化合物均有较好的耐受能力。因此，开展该菌中参与抗汞相关蛋白的结构与功能以揭示抗汞机制的研究，试图为汞污染修复提供理论基础。Hg401菌为革兰式阳性菌，属于广谱抗性菌，其抗汞能力主要依赖菌中的抗汞操纵子(mer operon)。mer操纵子编码一系列相关的抗汞蛋白，如有机汞裂解酶MerB、汞离子还原酶MerA、调控蛋白MerR及转运蛋白MerT/MerP等从而使细菌对汞产生一定的耐受性。
　　有机汞裂解酶MerB是广谱抗性菌系统中的关键性酶，可断裂C-Hg键将有机汞裂解成离子汞，参与生物的有机汞转化。Hg401菌中存在三种merB基因（merB1、merB2和merB3），我们将其分别克隆至大肠杆菌中研究三种转基因菌耐受汞化物能力及转化有机汞能力的差异性。实验结果表明:含merB1、merB2及merB3的转基因菌对汞离子的耐受性与普通无抗汞能力的大肠杆菌相当;但对甲基汞的耐受性则表现为明显差异，耐受程度分别为1.5ppm、1ppm及0.5ppm，merB1菌耐受甲基汞能力最强，其次是merB2菌，最弱为merB3菌。此外，我们将转基因merB菌暴露在含有机汞的培养基中培养并对各菌中的含汞情况进行了定性定量分析，发现:三种merB菌均具有转化有机汞为离子汞的能力，但三者转化有机汞的活性存在着明显的差异性。merB2菌转化有机汞能力较弱，而merB1和merB3菌转化能力较强，具有高效性。并且merB1菌比merB3菌转移汞离子更强，merB1菌将裂解有机汞生成的大部分离子汞排出体外，merB3菌则由于滞留大部分离子汞在体内而造成汞离子累积致死，从而大大降低了对有机汞的耐受性。
　　抗汞调控蛋白MerR是由merR基因编码的一个具有双功能转录调控的DNA结合蛋白，严格控制着整个mer操纵子相关基因的表达。MerR蛋白结合在启动子-35至-10区域之间，其调控作用主要基于MerR蛋白构象间的转变。Hg401菌中含有两种调控蛋白MerR1和MerR2，我们分别构建了含merR1和merR2基因的大肠杆菌进行表达纯化，获得了高纯度的MerR1和MerR2蛋白，并结合相应的DNA使蛋白更加稳定。通过将MerR蛋白分别与各二价离子混合经电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析，初步结果显示:MerR1可与Hg2+结合，可能结合Mg2+、Zn2+、Fe3+;MerR2不结合Hg2+，可能结合Mg2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+。初步探究了MerR有无与其它离子结合的可能性。设计MerR1和MerR2蛋白分别与DNA及二价离子共结晶，初步获得MerR1-DNA复合物晶体结构(分辨率2.9(A))以及MerR1-DNA-Hg2+/Mg2+/Zn2+晶体和MerR2-DNA晶体。从MerR1-DNA复合物的整体结构来看，MerR1单体蛋白间经疏水相互作用构成二聚体，N端的α螺旋和loop环分别插入DNA链的大沟和小沟中从而与其相结合，与DNA结合后的MerR1蛋白构象发生了细微的角度偏转变化，我们期望进一步解析蛋白核酸及离子的三元复合物结构，从而确定具体的作用位点及直观的构象变化，剖析MerR1蛋白调控下游基因的重要机制。同时也希望通过解析MerR2蛋白的晶体结构以及与DNA的复合物结构，探究蛋白MerR1与MerR2调控机理的区别。此项相关研究最终为构建高抗汞能力的工程菌以修复汞污染地区提供重要的理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 汞污染现状与危害

1．2 自然界中的汞循环

1．3 抗汞机制研究概述

1．4 细菌抗汞的生化解毒基础

1．5 抗汞操纵子的功能元件

1．5．1 调控蛋白

1．5．2 转运蛋白

1．5．3 抗汞性功能蛋白

1．6 汞在细胞中的传递与降解

1．7 抗汞基因在汞的去除和修复环境中的生物应用

第二章 转MerB基因菌株耐受汞能力及其转化有机汞能力差异性研究

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 样品和菌株来源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 基础溶液配制

2．1．4 常用实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌株对汞的耐受性检测

2．2．2 抗汞蛋白MerB转化有机汞能力测试

2．3 结果与讨论

2．3．1 菌株对汞的耐受性检测(MMC／HgCl2)

2．3．2 小结

2．3．3 抗汞蛋白MerB转化有机汞能力测试

2．3．4 小结

第三章 抗汞调控蛋白MerR的结构和功能研究

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 主要试剂

3．1．2 常用实验仪器

3．1．3 基础溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 基因克隆与载体构建

3．2．2 MerR蛋白的表达与纯化

3．2．3 MerR蛋白相关功能研究

3．2．4 MerR蛋白晶体的筛选与优化

3．2．5 蛋白晶体的数据收集与结构解析

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 基因克隆与载体构建

3．3．2 MerR蛋白的表达与纯化

3．3．3 MerR蛋白相关功能研究

3．3．4 MerR蛋白晶体的筛选与优化

3．3．5 蛋白晶体的数据收集与结构解析

3．3．6 小结

附表

参考文献

致谢