免疫复合物AIgG刺激小鼠肾小球系膜细胞增殖过程中Hint2基因的表达和作用

摘要

目的：
　　 1、观察免疫复合物AIgG刺激小鼠GMCs后不同增殖状态下Hint2-mRNA的表达量变化情况。
　　 2、观察Hint2蛋白过表达对免疫复合物AIgG刺激的小鼠GMCs不同增殖状态下的影响。
　　 方法：
　　 1、采用CCK-8法检测免疫复合物AIgG刺激体外培养小鼠GMCs增殖的量-效和时-效关系,筛选AIgG的最佳刺激浓度及作用持续时间。
　　 2、分别予不同浓度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激小鼠GMCs增殖36小时后,消化收集细胞并用PI染色法进行处理,再采用流式细胞术对细胞各周期的DNA含量进行检测,了解不同浓度的AIgG刺激对小鼠GMCs增殖状态的影响。
　　 3、采用SYBR Green Real-time PCR技术检测不同浓度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激小鼠GMCs增殖后的Hint2-mRNA表达量变化情况,观察小鼠GMCs的增殖状态与Hint2-mRNA表达量之间的关系。
　　 4、依次构建Hint2-Pmd19克隆载体及Hint2-MigR1表达载体,采用磷酸钙共沉淀法将MigR1和Hint2-MigR1质粒分别转染小鼠GMCs后,在荧光倒置显微镜下观察细胞转染后GFP表达情况,且流式细胞术检测其转染效率。
　　 5、将MigR1和Hint2-MigR1质粒分别转染小鼠GMCs后,并用流式细胞术将两者转染效率调整至一致后接种24孔板,分别予不同浓度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激小鼠GMCs36小时后,再用流式细胞术检测两者转染细胞GFP表达的阳性率,观察Hint2蛋白过表达对免疫复合物AIgG刺激的小鼠GMCs增殖的影响。
　　 结果：
　　 1、免疫复合物AIgG对体外培养小鼠GMCs具有明显的促增殖作用,增殖效应以2000ug/ml剂量组作用最强,作用36小时后达高峰。
　　 2、不同浓度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激能引起小鼠GMCs增殖指数(PI值)的改变,且组间P<0.05,同时提示小鼠GMCs细胞周期以进入S期阶段明显。
　　 3、SYBR Green Real-time PCR结果采用2-△△CT法相对定量分析提示不同浓度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激小鼠GMCs增殖后,细胞的PI值越高则Hint2-mRNA表达量越低。
　　 4、MigR1和Hint2-MigR1质粒通过磷酸钙共沉淀法皆能成功转染小鼠GMCs,荧光倒置显微镜可见GFP阳性的细胞,FCM检测两者转染效率分别为38.22％和20.44％。
　　 5、FCM检测不同浓度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激的转染的小鼠GMCs中GFP的阳性率:Hint2蛋白过表达组分别为9.99％、7.99％、8.69％,对照组分别为9.23％、8、47％、8.61％,示两组未见明显差异。
　　 结论：
　　 1、Hint2-mRNA的表达量与小鼠GMCs的增殖状态呈负相关。
　　 2、单独Hint2蛋白过表达对小鼠GMCs的增殖状态未见明显影响,可能通过协同其他凋亡相关基因发挥作用,间接调控小鼠GMCs的凋亡。