泊洛妙姆--阿霉素偶联物胶束克服肿瘤多药耐药作用的研究

摘要

化学药物治疗肿瘤存在两大问题：一是化学药物缺乏选择性，会对正常的机体组织产生较强的毒副作用；二是肿瘤细胞容易对化学药物产生耐药性，从而导致化疗失败。本课题以克服肿瘤的多药耐药性为目的，建立一种高效可行的具有一定肿瘤被动靶向性的药物递送系统，即首先将药物与高分子材料偶联，形成前体药物，将前体药物制备形成纳米级胶束，在体内外评价该胶束的药效学及克服肿瘤耐药性的作用。主要研究结果如下： (1)合成泊洛沙姆-阿霉素偶联物(DOX-P)：以泊洛沙姆188、阿霉素为原料，首先通过丁二酸酐与泊洛沙姆188反应，在泊洛沙姆188末端引入羧基，然后利用EDC/NHS方法，采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应，引入阿霉素合成得到泊洛沙姆-阿霉素偶联物(DOX-P)，并通过红外光谱、核磁共振方法进行结果鉴定，通过紫外测定法检测偶联物中药物含量，采用差热分析仪(DSC)，比较泊洛沙姆188与DOX-P两者在差热性质上的差异。通过本部分实验，合成得到了DOX-P偶联物，且反应效率高，偶联物中阿霉素含量达8.5％，理论上能满足用药要求。同时通过温度控制发现反应重复性好，制备工艺简单。由于在两亲性泊洛沙姆末端引入疏水基，理论上其形成胶束的能力增强。 (2)制备和表征DOX-P胶束：以DOX-P为材料，通过透析法制备胶束，同时以泊洛沙姆胶束及物理包载阿霉素的胶束作为对比，采用芘荧光探针法检测胶束临界胶束浓度，通过透射电镜观察外部形态，采用马尔文粒径电位测定仪进行电位和粒径的测定；另外，采用D2O和CDCl3分别作为溶剂，通过1H-NMR图谱对DOX-P胶束的核壳结构进行分析结果说明，阿霉素是分布在胶束的核芯位置，由于PEO嵌段的亲水性，会分布在胶束的外层，内核由阿霉素和PPO组成，然而PEO是连接阿霉素与PPO的媒介，证明该胶束的核/壳结构跟传统意义上的胶束结构存在差异。在药物体外释放实验中，DOX-P胶束对DOX有较好的缓释效果。结合低的临界胶束浓度值、高包封率、纳米级粒径、良好的渗透能力和控制释放行为等特点判断，DOX-P胶束可作为一种新的肿瘤靶向给药系统开发。 (3)DOX-P胶束用于治疗肿瘤的药效学评价：以A549细胞为模型，通过MTT法，在体外水平检测DOX-P胶束的抗肿瘤活性，发现DOX-P胶束与阿霉素IC50值相近，抗肿瘤活性相近；以A549细胞接种裸鼠建立皮下肿瘤动物模型，通过裸鼠肿瘤体积变化、肿瘤重量变化、裸鼠体重变化和血液中白细胞数等指标的检测，考察了DOX-P胶束与游离DOX在治疗肿瘤的差异，发现DOX-P胶束可以减小药物毒副作用，增强化学药物的治疗效果。 (4)DOX-P胶束用于治疗多药耐药肿瘤的体内外评价：以对阿霉素耐药的人肺腺癌细胞A549/DOX为模型，通过MTT法、荧光显微镜和流式细胞术等在细胞水平检测DOX-P胶束克服肿瘤多药耐药作用；以A549/DOX细胞接种裸鼠建立皮下肿瘤动物模型，检测裸鼠肿瘤体积变化、肿瘤重量变化、裸鼠体重变化等指标。结果发现，DOX-P胶束对耐阿霉素的人肺腺癌细胞A549/DOX的毒性大于游离的阿霉素，荧光显微镜观察和流式细胞仪分析均支持胶束能够增强耐药细胞对阿霉素的吸收。DOX-P胶束对A549/DOX的细胞毒实验表明DOX-P胶束可以增强DOX的抗肿瘤活性和克服A549/DOX细胞的多药耐药(MDR)。通过A549/DOX皮下接种肿瘤模型对DOX-P胶束的评价，表示DOX-P可以克服肿瘤的耐药性，增强DOX对肿瘤生长的抑制作用，提高裸鼠的生存质量。 总体来说，本研究首先通过化学合成方法制备了泊洛沙姆-阿霉素偶联物(DOX-P)，通过红外、核磁、差热分析、紫外等表征手段，证明了偶联物的合成成功，接枝率理论上能满足于给药的需求；然后将DOX-P制备成了纳米级胶束，同时以物理包载DOX的胶束作为对比，比较了CMC、粒径、电位、载药量、包封率、体外药物释放等方面的差异，发现DOX-P胶束可以有效的控制药物释放，稳定性、包封率均比物理包载方式理想，通过D2O和CDCl3分别作为溶剂得到1H-NMR图谱对DOX-P胶束的核壳结构进行了确认，外层由PEO组成，内核由阿霉素和PPO共同组成：通过体内外药效学评价，比较了DOX-P胶束与游离DOX在治疗肿瘤的差异，发现DOX-P胶束可以减小药物毒副作用，增强化学药物的治疗效果；通过体外A549细胞实验及A549/DOX皮下接种肿瘤模型对DOX-P胶束的评价，表明DOX-P可以克服肿瘤的耐药性，减小药物毒性，增强DOX对肿瘤生长的抑制作用。