环介导等温扩增技术快速检测环境水体中沙门菌的研究

摘要

沙门氏菌(Salmonella，SM)是一种普遍存在于自然界中的人兽共患病菌。它广泛分布于受污染的水体中，此致病菌对人类和动物健康有极大的危害。就评价受污染水质在流行病学上的安全度而言，沙门氏菌研究具有重要价值。因此加强被污染水体中沙门氏菌的控制与检查，成为饮水安全和公共卫生等方面亟待解决的重要问题。传统经典方法检测水中的沙门氏菌，需经过增菌、分离培养、生化指标检验、血清学凝集反应检验等一系列复杂步骤，因而不便用于检测环境水体中的沙门氏菌。因此需要建立一种快速、方便的沙门氏菌的检验方法。 环介导等扩增技术(loop-mediated isothemal amplification，简称LAMP)是2000年Notomi等开发出的一种新核酸扩增技术。该技术以其灵敏度高、特异性强、快速、操作简便、检测成本低等优点在病毒、真菌、细菌以及转基因食品的检测中得到应用。因此，建立LAMP技术检测沙门氏菌对于控制沙门氏菌的食物中毒具有重要意义。 本研究建立一种快速、敏感、特异的检测污染水体中沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)方法。该方法针对沙门氏菌的特异基因phoP，63℃恒温条件，加上Bst DNA聚合酶的作用，在1h内可完成对沙门氏菌基因扩增过程。 对反应时间、反应温度等进行了优化以确立了最佳反应条件。LAMP反应的总反应体系为25μL，引物终浓度如下：F3与B3各5pmol/L；BIP与FIP各40pmol/L；其它反应组分终浓度分别为：1.4mmol/L，0.8mmol/L Betaine，8.0mmol/LMgso4，2.5μLBst酶缓冲液(20mM Tris-HCI(PH8.8，25℃)，10mM KCI，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％.Triton X-100)，1μL(8U)Bst大分子聚合酶，2μL模板DNA，灭菌水补足体积到25μL。反应体系在恒温模块中63℃保存1h，80℃灭活酶10min。 本研究通过LAMP方法检测人工污染温瑞塘河水体及纯菌液对LAMP反应的灵敏度进行确定。结果表明：LAMP对沙门氏菌纯菌液的最低检出浓度为3.07fg/uL。利用LAMP技术直接检测人工污染的温瑞塘河水体中的沙门氏菌，其检出限为2.385×10CFU/mL。利用LAMP技术与传统培养方法同时检测温瑞塘河水体中的沙门菌，结果表明：LAMP技术检测出了污染水体中的沙门菌，而传统方法对同等水体中的沙门菌未检出。实际对温瑞塘河水5个不同分布点的7个月份的样品进行了检测，除了B7点少有月份存在外，其余点都有沙门菌存在，并在夏冬季节存在量的差异。 本研究建立LAMP检测沙门氏菌的快速检测方法，该方法灵敏度高、耗时短、方法简便，便于在基层推广，为检测污染水体中致病微生物构建了一个技术平台。利用ArcGIS工具可有效地对温瑞塘河水体病原菌的分布情况进行预测分析。