LTB4在THP-1源性巨噬细胞中通过MAPK途径上调EMMPRIN的表达

摘要

背景:
　　 目前急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)已成为我国城市和农村人口死亡的主要原因之一，且发病率有逐年增高的趋势。急性冠脉综合征包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)、不稳定型心绞痛(unstableangina pectoris，UAP)、心源性猝死，死亡率较高。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)与急性冠脉综合征的发生密切相关。冠状动脉粥样硬化是一种血管壁的炎症进展性疾病，单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞和基质金属蛋白酶不断聚集，使斑块的纤维帽降解，引起斑块不稳定，不稳定斑块破裂是导致急性冠脉综合征的一个重要原因。
　　 白三烯B4(LTB4)在动脉粥样硬化的发生发展中是一种功能强大的趋化因子和炎症介质，它是花生四烯酸通过5-脂氧合酶（5-LO）的作用产生的炎性脂质介质。ERK信号通路阻滞剂PD98059能显著降低LTB4的抗凋亡作用。白三烯能上调斑块内基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotenase-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotenase-9，MMP-9）表达，进而导致动脉粥样斑块不稳定、破裂。
　　 EMMPRIN（细胞外基质金属蛋白酶诱导因子）也称为CD147，是一种有两个免疫球蛋白样结构域的跨膜糖蛋白，它最初在许多肿瘤细胞的表面上被发现，能在成纤维细胞和单核细胞上诱导MMPs合成，很多研究证实，在动脉粥样硬化相关细胞，如单核细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞(SMC)上都可发现EMMPRIN高度表达，也可以增加血小板活性，促进动脉粥样硬化斑块的发展。在不同时间段用NIM811抑制EMMPRIN后发现MMP-9的表达量显著减少，同样的，在泡沫细胞中，EMMPRIN的增加使MMP-9的表达量显著增加，EMMPRIN在动脉粥样硬化斑块中和载脂蛋白E(ApoE)基因缺陷小鼠中被发现高表达，这些结果表明，E删PRIN在促进动脉粥样硬化斑块不稳定的过程中起着重要的作用。
　　 到目前为止，三种不同的丝裂原活化蛋白激酶途径(MAPK)已经被确定，即ERK1/2、P38、JNK/SAPK。许多研究证实，丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)在炎症方面起着重要的作用。
　　 国内外研究和我们前期研究均显示LTB4能增加MMPs的表达，但是否通过MAPKs途径增加EMMPRIN表达，进而增加MMPs的表达，国内外研究尚未有直接证据。
　　 目的：
　　 探讨白三烯B4在MAPK信号通路中对细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)表达的影响。
　　 方法：
　　 细胞培养人类单核细胞株THP-1细胞使用RPMI-1640培养基，在37℃，5％CO2培养箱中培养，培养基中加入10％胎牛血清，10mM HEPES。
　　 细胞处理在2-6组THP-1细胞中加入终浓度为100nM的PMA，在37℃，5％CO2环境中继续孵育24h，使悬浮生长的单核细胞分化成贴壁生长的巨噬细胞。4-6组分别加入终浓度为20uM的PD98059，SB203580，SP600125培养箱孵育1小时后3-6组分别加入终浓度为100nM的LTB4，继续培养箱孵育24h。
　　 明胶酶谱法(gelatinzymography)测定MMP-9的活性MMP-9为EMMPRIN的下游产物，通过MMP-9的活性变化来反映EMMPRIN的表达变化。6组分别取细胞培养上清液各10ul与上样缓冲液混合，经含0.1％明胶的SDS凝胶行非变性垂直电泳(120V，100min)，至溴酚蓝跑至底部，胶置2.5％TritonX-100中室温震荡孵育15min×2次。换用孵育液(0.05M Tris-HCl PH8.8，5mMCaCl，0.02％NaN3)，37℃中孵育16-20h，使用0.1％(w/v)的考马斯亮蓝R-250染色30-40min，脱色液[甲醇-冰醋酸-水(45∶10∶45)]脱色。
　　 RNA抽提和RT-PCR半定量分析用Trizol试剂提取总RNA，加入随机引物和M-MuLV逆转录酶合成cDNA。以cDNA为模板，PCR分别扩增EMMPRIN、MMP-9，设β-actin作为内参照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于BIO-RAD Gel2000凝胶成像仪上成像，Quantity One(BIO-RAD)软件作半定量分析。（EMMPRIN，上游引物:5'-GGTCACAGGGCACCGCTGGCT-3'下游引物:5'-CGGCCTCCATGTTCAGGTTCTCAA-3'; MMP-9，上游引物:5'-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3'下游引物:5'-CCCTCAGTGAAGCGGTACAT-3';β-actin，上游引物:5'-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3'下游引物:5'-GTCAGGCACGATTTCCCGCT-3')蛋白抽提和Western blot分析细胞经预冷PBS(PH7.4)冲洗后，加入4℃预冷的RIPA裂解液和PMSF，在冰上裂解30-60min，4℃，12000rpm离心30min，提取的蛋白进行BCA蛋白定量，与2×上样缓冲液煮沸变性5min。在10％SDS-PAGE胶中每孔加入总蛋白20ug进行垂直电泳(120V，90min)，半干转膜仪(BIO-RAD)转膜(15V，38min)，5％脱脂牛奶-TBST室温封闭2h，5％脱脂牛奶-TBST稀释EMMPRIN一抗(1∶1000)4℃轻摇过夜，二抗(1∶5000)室温孵育1.5h后用化学发光显色剂(Amersham)显色，感光、洗片。将所得照片扫描，输入计算机，用Quantity one软件扫描得吸光度值，以EMMPRIN、β-actin平均吸光度比值做定量分析。
　　 结果：
　　 1.THP-1细胞的上清液中MMP-9的活性极其微弱，几乎没有，THP-1细胞经过PMA诱导成巨噬细胞后MMP-9活性明显增加，但是加入LTB4的巨噬细胞组（3组）与不加LTB4的巨噬细胞组（2组）相比，MMP-9活性无统计学差异(P＞0.05)，加入PD98059阻断ERK1/2通路后，MMP-9的活性较第3组明显减少(p＜0.01)，加入SB203580阻断P38通路后，MMP-9的活性较第3组明显减少(p＜0.01)，加入SP600125后阻断JNK通路后，MMP-9的活性较第3组明显减少(p＜0.05)。
　　 2.THP-1细胞经PMA诱导成巨噬细胞后，EMMPRIN的mRNA表达量增加，但与1组相比，并无统计学差异，加入LTB4的巨噬细胞组与不加LTB4的巨噬细胞组相比，加入LTB4的巨噬细胞组的EMMPRIN的mRNA表达量明显增加(p＜0.05)，加入PD98059阻断ERK1/2通路后，EMMPRIN的mRNA表达量较第3组明显减少(p＜0.01)，加入SB203580阻断P38通路后，EMMPRIN的mRNA表达量较第3组明显减少(p＜0.01)，加入SP600125后阻断JNK通路后，EMMPRIN的mRNA表达量较第3组明显减少(p＜0.05)。
　　 3.THP-1细胞经PMA诱导成巨噬细胞后，MMP-9的mRNA表达量较THP-1细胞组明显增加(p＜0.01)，加入LTB4的巨噬细胞组与不加LTB4的巨噬细胞组相比，加入LTB4的巨噬细胞组的MMP-9的mRNA表达量明显增加(p＜0.01)，加入PD98059阻断ERK1/2通路后，MMP-9的mRNA表达量较第3组明显减少(p＜0.01)，加入SB203580阻断P38通路后，MMP-9的mRNA表达量较第3组明显减少(p＜0.01)，加入SP600125后阻断JNK通路后，MMP-9的mRNA表达量较第3组明显减少(p＜0.01)。
　　 4.THP-1细胞经PMA诱导成巨噬细胞后，EMMPRIN的蛋白表达量较THP-1细胞组明显增加(p＜0.01)，加入LTB4的巨噬细胞组与不加LTB4的巨噬细胞组相比，加入LTB4的巨噬细胞组EMMPRIN的蛋白表达量明显增加(p＜0.01)，加入PD98059阻断ERK1/2通路后，EMMPRIN的蛋白表达量较第3组明显减少(p＜0.01)，加入SB203580阻断P38通路后，EMMPRIN的蛋白表达量较第3组明显减少(p＜0.01)，加入SP600125后阻断JNK通路后，EMMPRIN的蛋白表达量较第3组明显减少(p＜0.01)。
　　 结论：
　　 白三烯B4通过激活MAPK信号通路增加THP-1源性巨噬细胞EMMPRIN的表达，可能是其增加巨噬细胞MMPs产生的机制。

目录

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

3 统计学处理

结果

分析与讨论

小结

参考文献

附录 技术路线图

致谢

综述 EMMPRIN研究进展

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