精子DNA损伤对胚胎发育潜能的影响

摘要

目的：
　　 在人类辅助生殖技术(ART)临床中，精子DNA损伤是影响其结局的重要因素之一，并且越来越受到生殖医学工作者的重视。在实施ART前，检测精子DNA断裂指数(DFI)，采取措施获得DNA损伤较小或无损伤的精子对改善ART结局十分必要。有报告显示，当精子接触外源氧自由基(ROS)时，DNA断裂明显增加，断裂的形式有全基质模式、产生无碱基位点、缺失、DNA交联和染色体重组。因此，精子在成熟过程中特别容易出现不同形式的线粒体DNA损伤和核体DNA损伤。有研究表明，在异常的精液样本中存在高发的线粒体DNA损伤，这一点表明了其在男性不育中的作用。DNA损伤的精子仍然有能力使卵子受精，但是胚胎形成发育的程度与DNA损伤密切相关。卵母细胞对精子DNA损伤有一定的修复功能，当DNA损伤的程度超过卵母细胞的修复能力时就会对胚胎质量产生影响。因此，检测精子DNA损伤并优选无损伤精子用于受精，对于提高ART结局具有非常重要的意义。现在检测精子DNA损伤常用的方法有彗星实验、精子染色质结构分析、末端转移酶介导dUTP末端标记法及精子染色质扩散实验等。本研究选择的方法是SCD方法检测精子DFI，探讨DFI与胚胎质量、胚胎种植率及临床妊娠率的关系，旨在研究精子DNA损伤对胚胎发育潜能的影响，为提高ART安全性和临床治疗效果提供实验依据。
　　 方法：
　　 研究对象为2010.10～2011.12期间于本中心行IVF/ICSI助孕的758例不育夫妇。参照世界卫生组织(WHO)的标准，经计算机辅助精液分析系统(CASA)分析精子密度及活动力，根据Tygerberg's标准评价精子形态，以此了解精子的质量。采用精子Halosperm试剂盒(Halotech dna，Spain)说明书介绍的方法行SCD检测，在200倍光镜下观察，比较精子核和核周围晕轮大小，计算精子DNA碎片指数。行IVF治疗患者的精液标准为正常精液指标、精子密度10-20×106/ml或活动率＞30％和洗涤精子数量＞500，000。行ICSI治疗男性患者精液指标标准为精子密度≤5-10×106/ml或活动率≤20-30％和洗涤数量≤500,000。
　　 女方患者均为单纯输卵管因素，入选所有周期获卵数在4个或以上。患者采用常规的超促排卵治疗方案，注射hCG后32～36h在阴道超声介导下取卵，采用常规IVF或ICSI进行体外受精，于卵母细胞受精后2～3日行胚胎移植。剩余胚胎继续培养成囊胚，观察D5、D6囊胚形成率。根据患者移植胚胎个数及种植个数计算胚胎种植率。
　　 结果：
　　 1、一般情况
　　 共纳入患者758例（758个周期），女性患者平均年龄为31.22±3.93，男性患者的平均年龄为33.55±4.64。患者平均获卵数为12.13±5.05，卵子成熟率为90.81％，受精率为74.37％，卵裂率为97.18％，临床妊娠率59.1％。IVF治疗组共有652例，其中DFI值＜15％组有471例，DFI值≥15％组有287例，IVF治疗组中低年龄组共有267例，高年龄组共有385例。ICSI治疗组共有106例，其中DFI值＜15％组有33例，DFI值≥15％组有73例。
　　 2、精子DNA损伤对常规IVF和ICSI临床结果的影响
　　 (1)所有患者根据治疗方法分成ICSI组和IVF组。每组再按照DFI值分为2组，(1)组DFI值＜15％，(2)组DFI值≥15％。结果显示ICSI组(1)和(2)两组之间受精率、卵裂率、D3优胚率、D5囊胚形成率、D6囊胚形成率、胚胎种植率及临床妊娠率比较，差异均不存在统计学意义(P＞0.05)。在IVF组，高DNA碎片组胚胎种植率和临床妊娠率显著高于低DNA碎片组(P＜0.01)，但受精率、卵裂率、D3优质胚胎率、D5囊胚形成率和D6囊胚形成率两组间无显著差异（P＞0.05）。
　　 (2) ICSI组与IVF组的差异比较，结果显示两组的D3优胚率、D5囊胚形成率及临床妊娠率存在统计学意义（P均＜0.05），丽卵子成熟率、受精率、卵裂率、D6囊胚形成率及胚胎种植率均无统计学差异(P＞0.05)。
　　 (3) ICSI组与IVF组两组中的低DFI组（即DFI值＜15％）之间的比较，结果显示，两组的D3优胚率、D5囊胚形成率及临床妊娠率存在统计学意义(P均＜0.05)，而卵子成熟率、受精率、卵裂率、D6囊胚形成率及胚胎种植率均无统计学差异(P＞0.05)。
　　 (4) ICSI组与IVF组两组中的高DFI组（即DFI值≥15％）之间的比较，结果显示，两组的D3优胚率、D5囊胚形成率及临床妊娠率存在统计学意义(P均＜0.05)，而卵子成熟率、受精率、卵裂率、D6囊胚形成率及胚胎种植率均无统计学差异（P＞0.05）。
　　 3、年龄对DFI影响IVF临床结果中作用的影响
　　 ICSI组病人例数较少，未予根据年龄分组。将IVF组根据年龄分为2组（低年龄组年龄＜30岁，高年龄组年龄≥30岁），每组再按照DFI值分为2组，(1)组DFI值＜15％，(2)组DFI值≥15％。结果发现，尽管低年龄组中高DNA损伤可导致D3优胚率和D6囊胚形成率显著下降（P均＜0.05），但受精率、卵裂率、D5囊胚形成率、胚胎种植率及临床妊娠率比较差异均无统计学意义（P＞0.05)。高年龄组(1)和(2)两组之间胚胎种植率、临床妊娠率差异有统计学意义(P＜0.05)，而受精率、卵裂率、D3优胚率、D5囊胚形成率、D6囊胚形成率及种植率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 结论：
　　 1、尽管精子DNA损伤不影响胚胎的种植前发育，但可减低胚胎的种植潜能，高精子DNA损伤可引起胚胎种植率和临床妊娠率的显著下降。
　　 2、精子DNA损伤对ICSI的临床结果无明显影响。
　　 3、ICSI治疗结局优于IVF，当精子DNA碎片率较高时，应选择ICSI的治疗方法。
　　 4、女方年龄是影响精子DNA损伤否影响常规IVF临床结局的重要因素。卵母细胞的修复能力与女性的年龄密切相关，高年龄组的卵巢功能较低年龄组较差，卵母细胞的修复能力较低，无论DFI值高低与否，卵母细胞的修复损伤能力较弱，所以DFI值不影响囊胚形成，但是显著减低胚胎种植率和临床妊娠率。低年龄组中，卵母细胞对低DFI组的精子DNA损伤有修复能力，对高DFI组的精子DNA损伤修复能力较差，故低年龄组中DFI值与早胚发育、囊胚形成发育呈负相关性。

目录

摘要

前言

材料和方法

一、实验对象

二、试剂

三、主要仪器

四、研究方法和步骤

结果

一、精子DNA损伤检测

二、精子DFI与年龄、治疗方法的相关性分析

讨论

结论

参考文献

致谢

综述 精子DNA碎片对胚胎形成发育的影响

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