洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的高效表达、纯化及其体外复性的研究

摘要

生物柴油作为理想的可再生清洁能源，是解决能源危机的重要途径之一，也是未来新能源开发的主要方向。相较于化学法，脂肪酶法制备生物柴油具有条件温和、转化效率高、环境友好等优点。但脂肪酶价格昂贵，导致生物柴油成本偏高，缺乏市场竞争力，已严重制约着酶法生产生物柴油工艺的产业化发展。因此，制备低成本脂肪酶对于生物柴油产业的发展具有重大意义。
　　 本文以理想的生物柴油专用脂肪酶——洋葱伯克霍尔德菌G63 脂肪酶为对象，扩增并表达了该脂肪酶及其折叠酶基因，研究了折叠酶辅助下脂肪酶的体外复性过程，并对复性后的脂肪酶的应用进行了初步探索。主要研究工作和结果如下：
　　 1．扩增了G63 脂肪酶及其折叠酶基因，并实现了二者在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。根据生物信息学方法对脂肪酶信号肽进行预测，利用pET-28a（+）质粒对N 端删除40个氨基酸残基信号肽的脂肪酶进行了表达。脂肪酶胞内表达以包涵体形式存在，利用高压/超声波破碎、脱氧胆酸钠处理的洗涤纯化方法制备了高纯度的脂肪酶包涵体，包涵体溶解于8M的脲中，包涵体蛋白质含量达到50mg/g cell-wetweight，包涵体用尿素溶解后浓度为4.085mg/mL。对折叠酶跨膜区域进行预测，利用pET-28a(+)质粒对N 端删除疏水性跨膜区域的折叠酶进行表达。折叠酶融合蛋白在胞内以可溶形式表达，表达产物N 端携带6×His 标签，利用Ni-NTA 金属亲和层析的方法制备了高纯度的折叠酶，透析除去咪唑后折叠酶的蛋白质浓度为0.67mg/mL。
　　 2．研究了变性脂肪酶在折叠酶的辅助下的体外复性过程。对复性过程中的折叠酶/脂肪酶摩尔比、温度、时间、pH 及蛋白质浓度等相关因素进行了考察，结果表明：
　　 当蛋白质浓度较低（0.8μg/mL）时，在复性条件（折叠酶/脂肪酶摩尔比1:1，温度15℃，时间5小时及pH7.0）下，脂肪酶复性后比活力可达1514.0U/mg；当蛋白质浓度较高（80μg/mL）时，在复性条件（折叠酶/脂肪酶摩尔比1:1，温度15℃，时间40 小时及pH7.0）下，脂肪酶比活力则达到2284.8U/mg。
　　 3．对复性后的脂肪酶进行了简单的工程化处理。将复性后的脂肪酶溶液分别进行冻干和固定化处理，以拓展其应用范围和潜力。冷冻干燥处理的复性脂肪酶水解酶活：pNP 法为694U/mg，橄榄油法为213U/mg；固定化的复性脂肪酶水解pNPP的比酶活为770.752U/mg。对复性脂肪酶后处理的探索，是推进复性脂肪酶工业化生产的一次尝试，具有方法学上的借鉴意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 绪 论

2 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶及其折叠酶的克隆、高效表达以及纯化

3 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的复性条件的研究

4 对复性脂肪酶应用的初步探索

5 小结与展望

致 谢

参考文献

附录