三种药用植物扬子毛茛、石龙芮和臭灵丹的抗病毒研究

摘要

病毒是一类严重危害人类健康的病原体。研究表明,有60％的疾病是由病毒感染引起的,而病毒感染性疾病已成为我国人口死亡的主要原因之一。新型病毒的不断出现,如人类免疫缺陷病毒,非典型性肺炎病毒等,则对抗病毒药物的开发提出更高的要求。病毒是一类细胞内病原体,其基本结构是核酸和蛋白质外壳,必须利用活细胞宿主的各种生物化学机制进行复制。病毒的结构、酶和复制机制均是抗病毒药物的作用靶点。但目前临床所用的抗病毒药物存在着毒副作用大、作用不彻底等缺陷,因此,开发新型抗病毒药物一直药物研究的热点之一。从植物中发现天然抗病毒药物,是开发抗病毒药物的重要途径。特别是我国的传统中医药和民族民间药物,蕴藏着丰富的宝藏,在发掘新型抗病毒有效物质和天然药物方面有着十分广阔的前景。
　　本研究分两部分,分别研究了扬子毛茛和石龙芮抗乙型肝炎病毒,以及臭灵丹抗流感病毒和单纯疱疹病毒的作用,从中发现了一些具有低毒高效的抗病毒化合物,为新型抗病毒药物的研究奠定了基础。第一部分、扬子毛茛和石龙芮抗乙型肝炎病毒研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染严重威胁着我国人民的生命健康和社会经济发展。目前我国总人口的10%感染或既往感染过HBV,而慢性HBV感染人数占全世界慢性HBV感染人数的一半以上。目前临床一线的抗HBV药物有拉米夫定,干扰素等,这些药物均存在毒副作用及耐药性等问题,所以开发新型的抗HBV药物已成为当今国内外新药研究的热点。毛茛属植物在我国资源丰富,产量大,一般具有小毒,有利湿退黄、温寒止痛、散寒通滞等功效,主要用于治疗肝炎、黄疸、疟疾、偏头痛、胃痛、扁桃体炎等。现代药理研究表明,毛茛属植物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等活性。我们在分离纯化两种毛茛属植物-扬子毛茛和石龙芮的化合物的基础上，以
　　HepG2.2.15细胞为模型，测定从扬子毛茛和石龙芮提取的共19种化合物的抗HBV活性。
　　样品由本研究组植化室提供，分别为芹菜素．4'-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4'-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-8-C-a-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-8-c-β-D-半乳糖苷、小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖苷、小麦黄素、木犀草素、东莨菪内酯、马栗树皮素、滨蒿内酯、阿魏酸、原儿茶酸、小毛茛内酯、豆甾-4-烯-3,6-二酮、豆甾醇、二十烷酸、β-谷甾醇、6-羟基-甲氧基香豆素以及原儿茶醛。
　　药物对细胞的毒性试验：胰酶消化细胞，以1*105个/mL浓度接种96孔板，每孔0.2 mL，37℃，5% CO2培养24h，待细胞贴壁后，换用10倍系列稀释的含药培养液，每个样品配制4种浓度，每浓度各3个复孔，同时设阴性对照。每4天换含样品的培养基，第12天以MTT法测定样品对细胞的毒性作用。
　　药物对HBV复制的抑制实验：以lX105个/mL浓度接种96孔板，每孔0.2 mL，37℃，5%CO2培养24 h，根据药物毒性实验结果，选用IC10为最大实验浓度，共设3个剂量组，每浓度各3复孔，同时设立空白细胞对照。每4天换含样品的培养基，第12天收获培养上清，同时测定乙型肝炎表面抗原(Hepatitis surface antigen，HBsAg)，乙型肝炎e抗原(Hepatitis e antigen，HBeAg)及HBV-DNA。
　　实验结果表明，6-羟基-7-甲氧基香豆素对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg有不同程度的抑制作用，而在实验浓度下，拉米夫定则无明显的抑制作用。
　　我们用定量PCR法测定了药物作用后HepG2.2.15细胞培养上清中HBVDNA浓度，结果显示：芹菜素-4- O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖苷和小麦黄素对HepG2.2.15细胞HBV-DNA的复制有不同程度的抑制作用，且随样品浓度增大其抑制作用增强。为了确证定量PCR试验的准确性，我们还用斑点杂交法测定有上述活性样品处理的HepG2.2.15细胞培养上清中HBV-DNA，试验结果证实了上述4个样品对HBV-DNA复制的抑制作用。
　　由于目前临床使用的一些抗病毒药物对肝脏等重要器官有一定的毒副作用，而研究表明这是由于这些药物对线粒体功能的抑制所致。因此，我们采用了多重PCR法测定样品处理后HepG2.2.15细胞中线粒体高变区DNA和持家基因β-actin之间的比例，以此确定样品对线粒体是否有抑制作用。实验表明，上述4个样品对HepG2.2.15细胞线粒体基因复制并无抑制作用，结果证实这些样品的安全性。
　　综上所述，我们测定了从扬子毛茛和石龙芮中分离出的19种化合物的抗HBV活性，结果表明芹菜素-4-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-D-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麦黄素-7-o-β-D-葡萄糖苷和小麦黄素等4个化合物对HepG2.2.15细胞HBV-DNA的复制有着抑制作用，而6-羟基-7-甲氧基香豆素对HepG2.2.15细胞HBsAg，HBeAg的表达有一定的抑制作用。我们同时以临床使用的拉米夫定作为阳性对照药，实验表明，其对HepG2.2.15细胞HBV-DNA地复制有很强的抑制作用，但对HBsAg，HBeAg表达基本无影响。
　　芹菜素-4-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖苷和小麦黄素等4个化合物均属黄酮苷类化合物，而黄酮苷类化合物有着明显的抗菌、抗病毒和保护心脏等作用。这些化合物抗HBV的作用机理还尚待研究，但从其对HBV作用效果和拉米夫定相比较，其都对HBV-DNA的复制有抑制作用，而对HBsAg，HBeAg表达基本无影响，因此我们推测其抗HBV的机理有可能在于对DNA聚合酶的抑制作用。
　　总之，扬子毛茛显示出较强的抑制乙型肝炎病毒复制的活性，有待于进一步深入研究并开发成治疗乙型肝炎的药物制剂。本研究首次证实了毛茛属植物悠久的治疗肝炎的药用历史的科学依据，揭示了扬子毛莨抑制乙型肝炎病毒复制的物质基础。
　　第二部分、臭灵丹抗病毒研究
　　臭灵丹(Laggera pterodonta DC.Benth)为云南民间的常用中草药，本品首载于《滇南本草》“其味苦、辛、性寒，有毒。阴中之刚也，治风热积毒，脏腑不和。通行十二经络，发散疮痈”。具有清热解毒、消肿拔脓之功效。据现代研究资料表明，臭灵丹的主要化学成分为黄酮类化合物、倍半萜类化合物等，其具有祛痰和抗肿瘤的作用，用于流行性感冒、呼吸道感染、扁桃体炎、腮腺炎、口腔炎、咽喉炎、支气管炎、疟疾等疾病的治疗。
　　本研究所用臭灵丹全草采自云南省腾冲县，由中国科学院昆明植物研究所彭华教授鉴定为臭灵丹(Laggera pterodonta DC.Benth)，药材存放中国科学院昆明植物研究所西南植物化学及植物资源国家重点实验室(No.200308LP)。
　　用热水醇提法制备臭灵丹提取物，用三氯化铁．铁氰化钾显色法测定提取物中总酚含量，并用HPLC法测定提取物中异绿原酸含量。结果显示，臭灵丹提取物中主要成分为酚类物质，总酚占提取物的53.0%，而异绿原酸占臭灵丹提取物的38%，为酚类化合物中的主要成分。
　　细胞长成单层的96孔板，弃去培养液，加入100 TCIDso病毒液，37℃、5% C02下吸附2h，弃去病毒液，加入2倍连续稀释的被试样品，每浓度3孔，37℃、5% C02下培养3天，显微镜下观察细胞病变，记录病变程度（Cytopathic effect，CPE），计算样品对病毒的抑制率及半数抑制浓度(IC50)。结果表明，臭灵丹提取物及异绿原酸体外对l型单纯疱疹病毒和、2型单纯疱疹病毒和甲型人流感病毒均有较强的抑制作用，异绿原酸应为臭灵丹提取物中抗病毒的主要活性成分。
　　用鸡胚法测定臭炅丹提取物对流感病毒的抑制作用，将不同稀释度的药液分别注射0.25 mL于鸡胚中，半小时后经相同途径注射100 EIDso半数感染量的病毒0.1 mL，孵育5天。收集尿囊液，测其血凝效价滴度。结果表明，臭灵丹提取物浓度为10mg/胚剂量组对流感病毒有明显的抑制作用。
　　以滴鼻法感染小鼠致小鼠流感病毒感染模型，并以此测定臭灵丹提取物对流感病毒致小鼠出血性肺炎的肺指数和肺指数抑制作用，以及对流感病毒致小鼠病变的保护作用。
　　本研究表明，臭灵丹提取物及异绿原酸在体外能有效抑制1型单纯疱疹病毒和、2型单纯疱疹病毒和甲型人流感病毒的复制，同时臭灵丹提取物能有效改善甲型流感病毒致小鼠肺炎病变并能显著降低病毒致小鼠死亡率。
　　本研究为臭灵丹用于治疗病毒感染性疾病提供了有力的证据。

目录

一、缩略词表

二、中文摘要

三、英文摘要

四、正文

第一部分、扬子毛茛和石龙芮抗乙型肝炎病毒研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分、臭灵丹抗病毒研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

五、综述

六、在读期间论文发表及专利申报情况

七、个人简历

八、致谢