产γ-聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌菌株选育及其发酵条件优化和产物分离

摘要

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物发酵合成的氨基酸聚合物，是由L-谷氨酸和(或)D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键连接而成。γ-PGA具有极强的水溶性、生物可降解性和生物相容性。γ-PGA及其衍生物在医药、化妆品及日化用品、农业等诸多领域有着广泛的应用前景。本文以地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CICC10099为出发菌株，通过诱变育种，筛选得到一株高产突变菌BacilluslicheniformisS16，对其液体发酵条件进行了优化，并在3.7L发酵罐中进行了分批发酵研究，最后对发酵液中的γ-PGA进行了分离纯化。 利用60Coγ射线对出发菌株进行诱变育种，并对诱变剂量进行了优化。当诱变剂量200Gy时，致死率大于90％，正突变率高达13.3％，200Gy为适宜的诱变剂量。诱变后经连续两次筛选复筛，并结合遗传稳定性分析，筛选出高产突变株BacilluslicheniformisS16，γ-PGA产量16.9g·L-1，比出发菌株产量提高72.4％。 采用单因素实验确定了影响菌株发酵合成γ-PGA的各因素的参考范围。用Plackett-Burman法对众多因素的效应进行评价并筛选出了有显著正效应的甘油浓度和MnSO4·H2O浓度以及和有显著负效应的K2HPO4浓度和装液量等四个因素。由中心组合实验及响应面分析确定了主要影响因素的较佳条件。在优化后的培养条件下，γ-PGA液体发酵浓度提高到19.23g·L-1。 在3.7L发酵罐中对分批发酵生产γ-PGA进行了初步研究。当装液量为2升，搅拌转速500r·min-1，通气量1.10VVM，培养基初始pH=7.5。控制pH=6.5发酵，菌体生物量和γ-PGA产量均有所增加，80hγ-PGA产量可达23.49g·L-1。对γ-PGA分离纯化进行了研究。确定分离纯化路线：发酵液→调pH至3.0,→8000r·min-1离心10min→发酵液上清液→3倍乙醇沉淀过夜，→8000r·min-1离心10min→沉淀物乙醇洗涤，溶解在蒸馏水中→调pH至3.0，去离子水中透析过夜→透析液→3倍乙醇沉淀过夜，→8000r·min-1离心10min→沉淀物甲醇洗净后，→40℃减压干燥2天→γ-PGA浅黄色粉末γ-PGA样品在6mol·L-1的HCI，110℃下，酸解36小时后水解完全。用水解液进行纸层析，只得到相当于标准品L-谷氨酸钠的斑点。利用高效液相法测定水解液中的L-谷氨酸钠含量，最终计算得到γ-PGA样品的纯度为95.7％。纯化的γ-PGA样品在228nm处有吸收峰，且由高效液相色谱检测，其峰面积占95.46％，与利用水解法计算得到的γ-PGA含量吻合。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1氨基酸聚合物与γ-聚谷氨酸

1.2 γ-PGA的研究进展

1.2.1 γ-PGA的结构与性质

1.2.2 γ-PGA的应用

1.2.3 γ-PGA的制备方法

1.2.4 γ-PGA生物合成的相关酶与基因的研究

1.3实验研究背景和主要内容

第二章诱变选育γ-聚谷氨酸高产菌株

2.1前言

2.2材料与仪器

2.3实验方法

2.4结果与讨论

2.4.1 60Co γ射线诱变效应与诱变剂量的选择

2.4.2诱变结果

2.4.3正突变株遗传稳定性考察

2.5本章小结

第三章γ-聚谷氨酸液体发酵条件的优化

3.1前言

3.2实验材料与仪器

3.3实验方法

3.4实验结果

3.4.1发酵条件的初步单因素优化

3.4.2影响γ-PGA合成的关键因素筛选

3.4.3中心组合实验结果

3.4.4响应面法分析优化的结果

3.5本章小结

第四章γ-聚谷氨酸分批发酵研究

4.1前言

4.2实验材料与仪器

4.3实验方法

4.4实验结果

4.4.1 γ-PGA分批发酵参数设定

4.4.2未控制pH值的γ-PGA分批发酵结果

4.4.3控制pH值的γ-PGA分批发酵结果

4.4.4发酵泡沫的解决方法

4.5本章小结

第五章γ-聚谷氨酸的分离纯化与测定

5.1前言

5.2实验材料与仪器

5.3实验方法

5.3.1 γ-PGA的分离提取方法

5.3.2多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法

5.3.3 γ-PGA的水解

5.3.4 γ-PGA水解物的纸层析

5.3.5谷氨酸含量的定量测定：高效液相色谱法测定

5.3.6 γ-PGA纯度鉴定方法

5.3.7 γ-PGA的吸收光谱测定

5.3.8 γ-PGA的高效液相分析

5.4实验结果

5.4.1 γ-PGA的分离提纯

5.4.2 γ-PGA的定性定量分析

5.5本章小结

结论

参考文献

致谢

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