半胱氨酰白三烯受体的基因转染及半胱氨酰白三烯受体2的信号转导

摘要

半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes,CysLTs,包括LTC4、LTD4和LTE4)是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)来源的一类重要炎症介质,通过激活其受体(CysLT受体)参与调节体内多种病理生理过程,如炎症、支气管哮喘、脑缺血再灌注损伤、创伤和休克等。CysLTs主要通过CysLT和CysLT2受体两种受体以及新发现的GPR17起作用。
　　 鉴于目前研究开发的受体拮抗剂大部分是CysLT1受体选择性拮抗剂,缺乏CysLT2受体选择性拮抗剂,所以,对CysLT1受体的功能研究较为深入,而对CysLT2受体的了解甚少。目前已克隆和鉴定两种半胱氨酰白三烯受体(CysLT1和CysLT2受体),但GPR17的研究较少,因此,构建GPR17真核表达质粒,可为研究其功能奠定基础。
　　 由于CysLT2受体与肺纤维化、动脉粥样硬化、脑缺血等疾病密切相关,因此,深入研究CysLT2受体功能特点非常必要。已有报道,CysLTs通过CysLT2受体可改变Egr-1和IL-8的表达,但是,具体通过哪条通路?Egr-1作为转录因子,对IL-8是否有调节作用?这些都不是很清楚。需要研究CysLT2受体激活后是否通过ERK1/2、Egr-1途径调节IL-8的分泌。
　　 第一部分大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定
　　 目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对该受体功能进行初步研究。
　　 方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD4处理后细胞内钙变化。
　　 结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD4可诱导细胞内钙的增加。
　　 结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞获得功能性表达。
　　 第二部分 CysLT受体基因转染及CysLT2受体信号转导
　　 目的:建立稳定转染半胱氨酰白三烯(CysLT)受体的HEK293细胞,并在此基础上研究hCysLT2受体激活后的信号通路。
　　 方法:采用脂质体转染的方法将pcDNA3.1-hCysLT1、pcDNA3.1-hCysLT2、pcDNA3.1-rGPR17转到HEK293细胞中,并用600μg/ml G418筛选得到阳性单克隆细胞株。用双荧光素酶报告基因检测IL-8激活程度。同时用RT-PCR、Western blot和细胞免疫组织化学法等方法检测Egr-1的表达,用RT-PCR和ELISA检测IL-8的表达和分泌,Western blot方法检测信号通路分子的激活。
　　 结果:双荧光素酶报告基因检测表明,HEK293转染hCysLT2的细胞,与转染hCysLT1和rGPR17这两种细胞比较,LTD4能明显够激活IL-8,且LTC4的作用强于LTD4。在hCysLT2-HEK293细胞中,LTC4能够诱导细胞内Egr-1、IL-8的表达增加,刺激IL-8的分泌。ERK1/2抑制剂(U0126)可以抑制Egr-1、IL-8的表达;对Egr-1进行干扰抑制细胞内Egr-1,可抑制IL-8的表达及分泌。
　　 结论:成功构建稳定表达hCysLT1、hCysLT2和rGPR17受体的HEK293细胞株;在hCysLT2-HEK293细胞,白三烯(LTD4、LTC4)可通过ERK1/2-Egr-1通路引起IL-8的分泌。
　　 总结
　　 1.成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞获得功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础。
　　 2.成功构建稳定表达hCysLT1、hCysLT2和rGPR17受体的HEK293细胞株。
　　 3.在hCysLT2-HEK293细胞中白三烯(LTD4、LTC4)可引起IL-8的分泌,IL-8的分泌主要是通过ERK1/2-Egr-1通路。

目录

文摘

英文文摘

致谢

1 引言

参考文献

2 第一部分 大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 结论

参考文献

3 第二部分 CysLT受体基因转染及CysLT2受体信号转导

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 结论

参考文献

综述 半胱氨酰白三烯受体激活后的信号转导

作者简历及在读期间所发表的论文