人CYP3A4与POR及cyt b5共表达条件的优化以及表达产物在药物相互作用研究中的应用

摘要

人细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是一大类含有血红素分子的单加氧酶超家族，对外源及内源性的物质代谢以及环境致癌物的活化都起着至关重要的作用。细胞色素P450中主要负责药物代谢的酶有3个家族：CYP1、CYP2和CYP3，包括了：CYP1A2、CYP2A6、CYP2A13、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4等。在人体内众多的CYP450中，CYP3A4是人肝脏中含量最丰富，也是与药物代谢最为相关的一类酶。
　　 CYP3A4代谢了大约50％的临床药物，具有广泛的代谢底物谱，并且底物结构和亲和力具有多样性。睾酮和咪达唑仑是CYP3A4活性鉴定的首选经典底物。CYP3A4催化的典型代谢途径有C-氧化，如尼古丁(nicotine)；N-氧化，如伏立康唑(voriconazole)；N-脱烷基，如芬太尼(fentanyl)；O-脱烷基，如氟西汀(fluoxetine)；脱氢，如澳哌利多(bromperidol)和氟哌啶醇(haloperidol)；硝基还原，如氯硝西泮(clonazepam)和C-羟化，如特非那定(terfenadine)(GuergerichFP et al.，1999)。
　　 人细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P4500xidoreductase，POR)是一个锚定在内质网膜上的重要黄素蛋白(Williams CH et al.，1962；Phillips AH et al.，1962；Pandey AV et al.，2010；Miller WL et al.，2011)，能通过其FMN与FAD辅基将NADPH上的电子传递给CYP450，以实现CYP450对底物的氧化功能(Porter TD etal.，1991；Pandey AV et al.，2010；Porter TD et al.，2011)。
　　 人细胞色素b5(Cytochrome bs，cyt bs)是细胞色素b家族一类膜锚定的蛋白。细胞色素bs携带有两个铁血红素基团，为其他膜锚定的加氧酶(如某些CYP450)传递电子。
　　 随着分子生物学技术的发展，克隆和异源表达基因重组人蛋白酶被越来越广泛的应用于科研当中。异源表达系统可以高效、大量地获得较高活性的重组人药物代谢酶，从而可以在体外对某一个单一的药物代谢酶进行研究。在实际的研究过程中，人们尝试比较了多种表达系统，其中杆状昆虫表达系统不仅表达量高，而且具有正确的糖基化、磷酸化和组织定位表达等优点，且所表达的蛋白生物学特性与天然蛋白相似，可以其建立高预测能力的代谢模型，对临床用药有很大指导意义。
　　 本实验采用Bac-to-Bac()杆状病毒昆虫细胞表达系统，共表达了CYP3A4、POR和cyt bs，并对表达条件进行了优化，获得了活性较好的CYP3A4、POR和cyt bs共表达微粒体。此外，我们将得到的微粒体对不同底物的代谢动力学进行了研究，并进一步进行了药物相互作用的研究。
　　 一.人CYP3A4、POR与cyt bs的构建及共表达目前用来表达药物代谢酶的表达系统有许多种，其中主要包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞和Bac-to-Bac()杆状病毒昆虫细胞表达系统。本实验采用病毒昆虫细胞表达系统来获得重组CYP3A4、POR和cyt bs的共表达产物。
　　 本实验通过自己设计引物，从实验室已有的载体上PCR得到CYP3A4、POR和cyt bs的目的基因。然后，将这些目的基因分别进行双酶切，酶切产物回收后与pFastBacTM1载体相连。连接产物转化至DH5α感受态细胞中，挑取单克隆进行PCR、双酶切鉴定，并经测序确证后，分别将重组pFastBacTM1-CYP3A4、pFastBacTM1-POR和pFastBacTM1-cyt bs质粒转化至MAX Efficiency DH10BacTMcompetent Escherichia coli中，在DH10Bac中发生转座，分别获得Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR和Bacmid-cyt b5重组粘粒。然后，分别用这些粘粒转染Sf9(Spodopterafrugiperda9)细胞，即可获得第一代重组杆状病毒P1，将P1经过扩增后依次得到P2、P3，一般P3即可用于蛋白的表达。
　　 将得到的v-CYP3A4、v-POR和v-cyt bs三种病毒分别按一定的比例(例如v-CYP3A4：v-POR：v-cyt bs=1:1:1)同时加入至一瓶Sf9细胞中，使其同时感染细胞发生共表达。同时，为了得到更高代谢活性的蛋白，我们又用新的载体pFastBacTMDual构建了pFastBacTMDual-POR-CYP3A4重组质粒。用上述同样的方法得到P3的v-POR-CYP3A4后，我们将该病毒与v-cyt bs按1:1的比例加入至Sf9细胞中进行CYP3A4、POR和cyt b5的共表达。
　　 为了进行蛋白的大量表达，提高目的蛋白的表达量，我们还对Sf9细胞的摇瓶培养条件进行了摸索。通过反复实践，我们发现当恒温摇床的温度为27℃，转速为90rpm，80-120ml每250ml摇瓶中加入细胞密度为5×105个/ml的细胞液，并加入0.1%的Pluronic()F-68，细胞培养72h时，最适合细胞的生长和目的蛋白的表达。
　　 二.CYP3A4对不同底物的代谢动力学研究CYP3A4是人药物代谢酶中最重要的酶，主要存在于肝脏和小肠中。CYP3A4酶约占人肝脏CYP450总量的30～40%(Paine MJ et al.，2000)，代谢了约38类多于150种的临床用药(Miners JO et al.，1996)，包括抗生素、抗真菌药、抗抑郁药、抗组胺药、钙拮抗剂、镇静催眠药及激素等(Crespi CL et al.，1997)。因此，针对CYP3A4单一酶的代谢研究在药物代谢学以及临床药理学上都占据着重要的地位。
　　 本实验通过Bac-to-Bac()表达系统获得CYP3A4、POR和cyt b5共表达产物，制备成微粒体，然后利用这些微粒体分别对睾酮和咪达唑仑这两种底物进行代谢，经过动力学曲线的拟合，分别得到两条代谢动力学曲线以及各代谢动力学参数。此外我们还对这两种代谢底物及产物的方法学、孵育条件和高效液相色谱(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)条件进行了考察。通过对各底物代谢动力学的分析，我们得到共表达微粒体对睾酮和咪达唑仑这两种底物代谢时的动力学参数分别为：睾酮，Km、Vmax与CLint分别为119.6±13.79μmol/L、0.52±0.026μmol/min/g protein和4.34 mL/min/g protein；咪达唑仑，Km、Vmax与CLint分别为6.79±0.56μmol/L、0.11±0.0029μmol/min/g protein和15.56 mL/min/g protein。
　　 本文运用在Sf9中共表达CYP3A4、POR和cytb5得到的微粒体对睾酮和咪达唑仑这两种底物的代谢动力学进行了研究，并分别对其方法学、孵育条件和HPLC条件进行了考察。
　　 三.CYP3A4在药物相互作用研究中的应用由于CYP3A4广泛的代谢底物谱，许多药物不良反应(Adverse Drug Reaction，ADR)是由CYP3A4代谢药物之间的药物相互作用(Drug-Drug Interaction，DDI)所引起的(Guengerich FP et al.，1997)。因此异源重组表达CYP3A4，并研究其底物之间的药物相互作用可以为临床上体内的药物相互作用提供可靠的参考(Masimirembwa CM et al.，1999)。
　　 本实验将上述共表达得到的微粒体用于考察酮康唑对睾酮代谢的影响以及咪达唑仑与睾酮之间的相互影响。最终，我们得到：随着浓度的增加，酮康唑对CYP3A4代谢睾酮生成6β-羟基睾酮的抑制作用逐渐增强，通过Dixon作图法我们得到其抑制常数Ki值为0.0594±0.00586μM。在咪达唑仑对睾酮代谢影响的实验中，当底物睾酮的浓度低于Km时，咪达唑仑对CYP3A4代谢睾酮生成6β-羟基睾酮具有明显的抑制作用，并且这种抑制作用随着底物浓度的降低而增强。而当底物睾酮的浓度达到200μM时，只有较高浓度的咪达唑仑(大于40μM)才对睾酮的代谢具有抑制作用，较低浓度的咪达唑仑反而对睾酮的代谢具有促进作用。而在睾酮对咪达唑仑代谢影响的实验中，睾酮对不同浓度咪达唑仑的代谢都有明显的抑制作用，并且这种抑制作用随着底物浓度的降低而增强。
　　 本课题得到的实验结果提示，利用Bac-to-Bac()表达系统共表达得到的CYP3A4、POR和cyt b5微粒体具有较高的代谢活性，说明优化后的表达条件适合于CYP3A4的表达，并可进一步推广至其他CYP及UGT等药物代谢酶的表达；同时，经过进一步优化，还可以将其应用于药物代谢酶的大规模表达及工业化生产。CYP3A4具有较宽的代谢底物谱，通过对其底物或抑制剂之间的体外药物相互作用研究，我们可以预测药物在体内潜在的药物相互作用，从而可以避免某些临床上的药物不良反应。