CYP3A4及其四种突变体与POR和Cyt b三重共表达体系的建立与活性比较

摘要

本课题应用杆状病毒-昆虫表达系统异源表达了人CYP3A4野生型蛋白质及CYP3A4.3、CYP3A4.4、CYP3A4.5和CYP3A4.18四个功能变化的突变体蛋白质，并比较了野生型蛋白质与突变体之间的代谢动力学参数，同时还研究了各重组蛋白质的非典型动力学性质。CYP3A4突变体蛋白质的成功表达为CYP3A4突变体体外药物代谢研究提供了单一的酶源。
　　 目的:表达CYP3A4野生型蛋白质及CYP3A4.3、CYP3A4.4、CYP3A4.5和CYP3A4.18四个突变体蛋白质，利用CYP3A4经典底物睾酮比较代谢动力学差异，同时为药物I相代谢的体外研究提供单一性的酶源。
　　 方法:以CYP3A4野生型序列通过定点突变获得四个突变体的cDNA序列。将这些基因分别连接至pGEM-T载体进行测序，选取正确序列的CYP3A4四个突变型基因连接至pFastBac质粒，将重组质粒pFastBac-3A4s转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，经过转座作用，产生重组粘粒(Bacmid-CYP3A4)。将各重组粘粒转染Sf9细胞后，即产生重组杆状病毒。CYP3A4介导的药物代谢需要细胞色素氧化还原酶(POR)和细胞色素bs的参与，由于昆虫细胞Sf9本身的POR和bs表达水平比较低，并且不含有血红素，因此在CYP表达的时候，需要添加POR，bs和氯高铁血红素。将构建好的CYP3A4病毒，与本实验室已构建好的P450氧化还原酶(POR)、CYP bs病毒一起加入Sf9细胞中共表达这三种蛋白质以获得有代谢活性的重组酶。通过测定共表达方法中三种病毒间不同的比例、不同的细胞感染复数值，以及不同的表达时间等条件下的活性，选取最佳表达条件。采用RT-PCR在mRNA水平上验证CYP3A4s基因在表达；采用western-blot检验细胞是否在蛋白质水平上表达了各重组人CYP3A4蛋白质，以及表达的水平。以睾酮和7.甲氧基-4-三氟甲基香豆素作为底物，分别检测重组酶的活性，最后利用睾酮比较CYP3A4野生型与突变体之间的代谢动力学性质，采用米氏方程模型比较了野生型和突变体蛋白质的代谢动力学参数，利用Hill等式模型拟合分析了野生型和突变体蛋白质的非典型动力学性质。
　　 结果:对构建各CYP3A4各重组病毒的每个步骤进行鉴定，结果表明本实验成功构建了含有正确基因序列的各重组CYP3A4病毒。将各重组CYP3A4病毒分别感染Sf9细胞，通过RT-PCR实验验证了目的基因在mRNA水平上的表达；利用western blot实验验证了目的蛋白质在蛋白质水平的表达。最后以CYP3A4经典睾酮为底物，对重组酶的代谢活性进行了检测，CYP3A4野生型及CYP3A4.3、CYP3A4.4、CYP3A4.5和CYP3A4.18突变体重组酶对睾酮的代谢动力学参数Km分别为136、147、192、430和110μmol·L-1，Vmax分别为64、120、187、73和212pmol·min-1·g-1蛋白质。应用Hill方程拟合代谢实验数据得到S50为130、150、170、180和130μmol·L-1，Vmax分别为63、122、180、44和228 pmol·min-1·g-1蛋白质，n值为1.03、0.98、1.10、1.38和0.93。
　　 结论:与野生型CYP3A4比较，CYP3A4.5活性明显低于野生型，而CYP3A4.3，CYP3 A4.4和CYP3A4.18活性高于野生型，尤其以CYP3A4.18的活性最高。非典型动力学模型拟合的结果发现CYP3A4.4和CYP3A4.5可能具有正协同性质，而CYP3A4.18可能具有负协同性质。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

致谢

1绪论

1.1前言

1.2 CYP3A4的基因多态性

1.3 CYP3A4的晶体结构

1.4 CYP3A4的非典型动力学特性

1.5重组酶体外表达技术

1.6本文实验设计

2.人CYP3A4*3/*4/*5/*18A基因的重组杆状病毒的构建

2.1实验仪器与材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4小结与讨论

3.人CYP3A4.3/.4/.5/.18重组蛋白质的表达

3.1实验仪器与材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4小结与讨论

4.人CYP3A4各突变体重组蛋白质与野生型活性比较

4.1实验仪器与材料

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4小结与讨论

主要创新性

参考文献

作者简历及在读期间发表的论文